稳定同位素——如何玩转质谱内标定量

2023-11-06 14:31:28, 小 M MedChemExpress (MCE)

小 M 带大家了解过稳定同位素如何联动代谢组学研究(可戳前文：稳定同位素，如何联动代谢组学研究？)。今天小 M 再和大家探讨下稳定同位素与质谱检测的搭配组合会带来怎样的惊喜呢？一起来看下吧~

稳定同位素——质谱内标定量的极佳选择

质谱分析具有灵敏度高、样品用量少、分析速度快、分离和鉴定同时进行等优点。随着质谱定量检测技术的广泛发展，稳定同位素类化合物作为内标定量 (Stable Isotope-Labeled Internal Standard，简称 SIL-IS) 目前已被公认为是质谱定量分析领域的极佳选择。因为稳定同位素类化合物与被分析物具有几乎完全相同的分子结构 (图 1)、化学性质、色谱和质谱行为，可以有效地消除电离变化和基质效应^[1]，因而受到越来越多科研人员的推崇，广泛用于临床医学研究及生物医学、环境科学、食品检测等领域。

图 1.未标记的依喜替康甲磺酸盐 (左) 同位素标记的依喜替康甲磺酸盐 d5 (右)

稳定同位素作内标，可以减少基质效应、减少实验的人为误差、提高检测的准确度和精密度、同时检测多个数据、提高实验效率，好处多多。那么稳定同位素作为内标的关键量值指标有哪些，该如何挑选稳定同位素内标呢？干货如下，拿走不谢~

1. 稳定同位素作为内标的关键量值指标

a. 同位素产品纯度：一般 ≥ 98%。常指色谱纯度，如 LCMS/MS，GCMS，HPLC 等，如果产品吸收或者 MS 较弱，也可以用 NMR 检测等。

b. 同位素产品丰度 (Isotopic Enrichment)：一般 ≥ 98%。

c. 同位素产品有效期：同位素化合物内标均在有效期内使用。

2. 如何挑选稳定同位素内标

a. 除非实验特殊需求下，一般不选择有活泼氘 (²H) 取代的同位素产品作内标 (如氨基、羧基、羟基上的氢被氘取代)，这些活泼氘极易被交换为氢。

b. 同位素标记的 ¹³C 和¹⁵N 化合物稳定性较好，但是 ¹³C和¹⁵N 的价格相对较贵些。目前市场上含有氘 (²H) 的同位素产品因为价格相对便宜且数量相对较多，因此在满足实验要求的情况下，也可选择氘代物作为内标。

c. 选择氘 (²H) 代化合物作为内标时，一般选择比非同位素产品分子量多 3 及以上的产品 [即含有氘原子个数为 3 个 (D3) 或者以上]。

稳定同位素的应用

在有机分析研究中，质谱分析法比化学和光学分析法具有更加卓越的性能，而稳定同位素作内标成为了质谱定量的金标准，下面就随着小 M 来看下稳定同位素内标在质谱定量分析中的实际应用吧~

一、糖尿病人视网膜病变治疗研究中的应用

Candesartan 和 Irbesartan 已被证明能有效预防糖尿病视网膜病变造成的损伤。为了开发新型治疗此疾病的滴眼剂配方，Tan A 等人利用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 稳定同位素做内标，开发了一种新的 LC-MS/MS 方法，此方法可同时定量测定出兔眼组织中 Candesartan & Irbesartan 的含量，并对该方法的浓度范围、准确度及精密度、基质效应、样品回收率等均做了验证。该方法也已成功应用于家兔的体内生物分布和药代动力学研究^[2]。

图 2. Candesartan 和 Candesartan-d4, Irbesartan 和 Irbesartan-d4 的化学结构

图 3. 稳定同位素类化合物做内标实验流程图

那么如何操作呢？实验的具体过程如下：

(1) Candesartan & Irbesartan 标准液及其同位素内标液制备

在乙腈/水 (80/20，V/V) 中配置 Candesartan & Irbesartan 的标准液和内标液，标准液分配成 200 和 500 μg/mL，内标液配置 500 μg/mL 备用，放置于 -20 ℃ 备用。

(2) 样品前处理

称量好的兔眼组织样品在稀释的兔血浆中以 1:19 的比例混合均匀，其匀浆上清液保存于 -80 ℃。取 200 μL 的兔组织匀浆上清液依次与 100 μL 内标液溶于甲醇/水 (20:80，V/V) 和水混合。然后将混合物装载到预处理的 HLB 柱中洗脱。洗脱后的纯品用 200 μL 甲醇/水/甲酸 (70:29.75:0.25，V/V/V) 复溶。

(3) LC-MS/MS 分析样本

将 (2) 中稀释好的的样品 20 μL 注入 C18 柱进行梯度分离，柱温 25 ℃，流速 0.8 mL/min。Candesarta 和 Candesarta-d4 在 5.1 min 洗脱，Irbesartan 和 Irbesartan-d4 在 4.1 min 洗脱。MS 检测采用正电喷雾电离 (ESI) 模式。

(4）数据分析

通过分析六批次 456 个兔组织样本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 做内标，准确测定了兔组织样本中在角膜、房水和玻璃体样本中的精确含量，测定出 Candesartan 在角膜中含量为 1704.75 ng/g，在房水中的含量为 63.45 ng/g；Irbesartan 在角膜中的含量为 3546.30 ng/g，在玻璃体中的含量为 36.52 ng/g.

图 4. Candesartan 在角膜和房水样本中的

LC-MS/MS 色谱图

通过分析六批次 456 个兔组织样本，用 Candesartan-d4 & Irbesartan-d4 作内标，准确测定了兔组织样本中 (角膜、房水和玻璃体) 的精确含量，测定出 Candesartan 在角膜中含量为 1704.75 ng/g，在房水中的含量为 63.45 ng/g。

二、COVID-19 药物治疗研究中的应用

全球 COVID-19 爆发以来，对此疾病的药物治疗研究备受科研工作者的重视。据报道，Ibuprofen 可以有效缓解与 COVID-19 相关的症状。Ibuprofen 的疗效及其不良反应与其在血液中的浓度密切相关，所以准确定量测定 Ibuprofen 在血液中的浓度至关重要。

图 5. Ibuprofen 和 Ibuprofen-d3 的化学结构

Changmao Wang 等人用稳定的同位素标记 Ibuprofen-d3 做内标简单、高效、准确地定量测定人血浆中的 Ibuprofen 含量，该方法不但检测时间短，且无基质效应及个体间差异性的影响，已成功应用于 18 名健康中国志愿者口服 Ibuprofen 颗粒后的临床药代动力学研究，其结果证明了 Ibuprofen 可以改善 COVID-19 免疫反应并缩短患者的康复时间^[3]。

图 6. Ibuprofen 及 Ibuprofen-d3 在血脂、

溶血和人血浆中的基质效应表，

显示 Ibuprofen-d3 作内标基质效应无影响

跟着 M 君已经了解了这些稳定同位素内标在质谱定量分析中的应用，您目前是否也想尝试下稳定同位素产品在实验中的应用呢？下面就让 M 君带您浏览下 MCE 稳定同位素类产品吧！

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参考文献

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1. Ulvik A, Ueland PM, et al. Quantifying Precision Loss in Targeted Metabolomics Based on Mass Spectrometry and Nonmatching Internal Standards. Anal Chem. 2021 Jun 1; 93 (21):7616-7624.

2. Tan A, Fanaras JC, et al. Simultaneous quantification of candesartan and irbesartan in rabbit eye tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 2020 May; 34 (5): e4808.

3. Wang C, Jia Y, et al. Establishment and validation of an SIL-IS LC-MS/MS method for the determination of ibuprofen in human plasma and its pharmacokinetic study. Biomed Chromatogr. 2022 Mar; 36 (3): e5287.

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