综述｜MALDI质谱成像在药代动力学研究中的应用

药物或其代谢产物在组织中的丰度和分布是了解药物疗效和毒性的关键因素。均质处理常用于检测药物在整个组织中的浓度，但由于组织微环境具有异质性，因此预测药物在组织中的分布是十分困难的。质谱成像(MSI)是一种强大的分析工具，具有免标记、高通量、信息丰富的优点，能够可视化组织切片中药物以及内源性分子的空间分布和丰度，在药物研究领域引起了广泛关注。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MSI）是药代动力学（PK）成像领域中应用最为广泛的质谱成像方法。

图 1 PK成像的概念。

日本国立癌症中心研究所的Akinobu Hamada等人于2019年在Drug Metabolism and Pharmacokinetics期刊上发表了题为 “Applications of MALDI mass spectrometry imaging for pharmacokinetic studies during drug development”的综述文章。作者介绍了MALDI-MSI在PK成像研究中的最新应用，概述了MALDI-MSI的流程，还强调了内标的重要性，并详细介绍了四种定量方法，最后指出了标准化MALDI-MSI技术的必要性。

首先要使用喷涂仪器将基质施加到组织切片（厚5-20μm）上。喷涂到切片表面的基质溶液，能够萃取组织中的分析物并与其形成共结晶，以辅助分析物电离。气相沉积的喷涂方法可以在切片表面形成小的结晶且没有溶剂扩散，因此特别适合高空间分辨率的成像分析。

然后，通过市售质谱仪进行电离和离子检测，根据空间信息和离子强度数据在成像软件中生成二维图像。需要注意的是，成像前应根据基质种类、目标组织以及仪器的不同确定最佳分析条件。并且应确保基质喷涂均匀以及使用内标对分析物进行归一化处理，以获得目标分子的精确分布。

在MALDI-MSI分析中，药物的电离效率与组织生物成分紧密相关，其很大程度上影响了检测的灵敏度和定量能力。因此，在比较不同器官或同一组织切片的不同区域时，必须考虑离子抑制，尤其是对于大脑、肾脏或异质肿瘤等解剖复杂的组织。综上所述，基质不均匀或组织成分对离子的抑制会妨碍分析物的丰度和空间定位。因此，在MALDI-MSI分析中应进行归一化处理。

借助外源性内标（例如稳定的同位素标记物或结构类似物）可以实现MALDI-MSI的归一化。将内标物应用于组织样本，利用内标的信号强度对分析物的信号强度进行归一化计算。此外，使用总离子电流(TIC)、均方根(RMS)或峰的中值强度也是MALDI-MSI数据归一化的常用策略。也有方法根据组织或组织区域间不同的生化微环境，提出了组织特异性电离效率归一化因子——组织消光系数(TEC)，以实现归一化。

由于难以制备包含已知浓度药物的对照组织，无法得到切片上分析物的标准曲线，研究人员提出了各种定量质谱成像（qMSI）的方法，有溶液法、组织上法、组织内法和连续切片法（图2）等。

图 2 四种不同MALDI-MSI定量方法的比较。

图 3 连续切片法的操作流程

溶液法是基于载玻片上梯度浓度的标准物进行定量。组织上法是将梯度浓度的标准溶液沉积在空白组织样本上实现定量。组织内法是将梯度浓度标准物与空白组织匀浆混合点样，以模拟切片中分析物的环境。连续切片法是利用LC-MS/MS对相邻切片的药物含量进行测定，间接确定中间切片的药物含量（图3）。

已有大量研究报道了MALDI-MSI在非临床和临床PK成像中的应用。例如，在非临床应用方面，Nishidate M等人将MALDI-MSI与LC-MS/MS相结合，研究了表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂埃罗替尼和人源化抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗在EGFR突变的非小细胞肺癌癌症中的分布。

在MALDI-MSI的临床应用方面，抗结核药物异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和莫西沙星在结核病患者肺组织中的定位已得到研究。厄洛替尼在肺癌患者和动物模型中的分布也有报道。

图 4 使用交替扫描模式（SIM, FS）在同一动物的小鼠肺切片中检测结核抗生素。标尺=1mm。(A) H & E染色图像, (B) FS模式检测RIF [M-H]- m/z 821.39784（m/z 400 – 900）；(C)SIM模式检测RIF（m/z 810 – 830）; (D)PI (38:4) [M-H]- m/z 885.54985（绿色）和PS (38:4) [M-H]- m/z 810.52905（蓝色）的叠加图像，像素30μm; (F)SIM模式检测PZA [M+2H]+· m/z 125.05836（m/z 120 – 140）; (G)FS模式检测CFZ [M+H]+ m/z 473.12942（m/z 450 – 900）; (H)PC (36:4) [M+K]+ m/z 820.52531（绿色）和PC (30:0) [M+K]+ m/z 744.49401（蓝色）的叠加图像，像素30μm。

随着MALDI-MSI在药物研究中的应用不断扩大，其开发和评估可能会有越来越多的困难。因此，需要标准化的方法开发指南，以确保数据的可靠性。有研究者将不同的方法、仪器和实验室得出的结果进行对比，极大地促进了方法标准化。也有研究对qMSI方法的灵敏度、准确性、精密度或选择性等项目进行了评估。但尚未有人对PK成像进行评估。用于系统验证的白皮书或建议也尚未发布。从监管科学的角度来看，测量生物样品中药物浓度的MALDI-MSI方法评估或验证的主要项目有再现性、准确性、精密度、特异性、选择性、灵敏度和稳定性。

MSI在过去的十年中取得了巨大的进步，是一种很有前景的技术，可以在不影响组织和结构信息的情况下对无标记生物分子和药物进行定位。在非临床研究中，MSI和定量全身放射自显影(QWBA)是分析药物分布的互补技术。MSI不需要标记，而QWBA不需要样品预处理，这降低了分析物扩散的风险，提高了方法定量能力且可以处理大量样品。但MSI在药物开发中的应用仍存在一些挑战，包括但不限于改进MSI方法的定量能力、灵敏度、空间分辨率、吞吐量、质谱分辨率和数据分析。在使用MSI分析人体样本时，由于制备过程复杂，作者认为标准化的样品制备流程有助于MSI分析人体样本方法的推广。考虑到MSI数据在药物研发中的重要性，有必要对MSI分析方法进行评估和标准化，以确保数据的可靠性。

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