PROTAC药物代谢物研究 | SCIEX 7600 系统准确鉴定GNE-987氧化代谢产物位点

蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis-Targeting Chimera, PROTAC）是一种杂合双功能小分子化合物，结构中含有两种不同配体，一个是泛素连接酶 E3 配体，另一个是与细胞中目标靶蛋白结合的配体，两个配体之间通过 Linker 相连，从而形成“三体”聚合物——靶蛋白配体-Linker-E3 配体。然后通过 E3 连接酶给靶蛋白加上泛素化标签，启动细胞内强大的泛素化水解过程，通过泛素-蛋白酶体途径特异性地降解靶蛋白，因其扩展了可成药靶点的覆盖范围，并有潜力解决小分子抑制剂的耐药性问题，因此在生物医药领域的学术界、产业界和投资界均引起了广泛关注^[1]。GNE-987是一种降解溴结构域蛋白4 （BRD4）的PROTAC，由VHL配体、BRD4配体与间隔基团组成，具有皮摩尔级别的BRD4降解活性，所以这也给它的安全性和活性评价带来了一定难度。

PROTAC药物的安全性挑战主要涉及脱靶蛋白降解、与传统小分子药物在药物动力学/药效学（PK/PD）上的差异，以及在非临床试验中选择合适的种属进行安全性评估^[2]。通过体外代谢产物鉴定研究，可以帮助识别PROTAC的代谢位点，以指导PROTAC的结构优化得到更具代谢稳定性的化合物。肝微粒体体外温敷法较其他的体外肝代谢方法而言，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品用于结构鉴定；同时，该方法可以用于对酶的抑制和诱导、体外代谢清除和药物相互作用的研究，因而在实际工作中应用较为广泛，是研究体外代谢的常用方法之一。

药物代谢产物的结构鉴定是药物代谢研究的核心与难点，PROTAC分子因其结构的复杂性使得其代谢产物鉴定的工作面临较大的挑战。质谱分析在药物代谢研究领域发展十分迅速，尤其是高分辨率质谱以其高分辨率和突出的定性分析能力等优势逐渐成为研究药物代谢产物及代谢转化途径的强有力工具。SCIEX高分辨质谱 ZenoTOF^® 7600 系统既含有根据化学键键能强弱产生二级质谱碎片的CID模式，又含有基于低能电子和带电离子相互作用，从而产生更加丰富碎片的EAD模式，可以为药物代谢产物位点的确认带来巨大的帮助。

将GNE-987与人肝微粒体共同孵育后，样品中出现m/z 1128.45的离子，根据其精确一级质荷比和[M+H]⁺的CID二级质谱碎片信息（如图1），推测其为GNE-987的双氧化产物。另外， m/z 431.21、m/z 483.09和m/z 811.33的二级质谱碎片，经过归属，可推测氧化发生在Linker的脂肪链上，但具体位点无法确定。在其[M+Na]⁺的EAD二级谱图中（如图2），出现一系列丢失-CH₂所产生的质谱碎片，另外m/z 567.22→m/z 551.23和m/z 523.19→m/z 507.20，提示在这两个位点分别丢失-O，即氧化发生位点。