最新｜高分辨AP-SMALDI MSI技术助力揭示人源小胶质细胞的脂质特征和细胞间异质性

2023-08-14 12:52:41, Create 科瑞恩特（北京）科技有限公司

摘要

小胶质细胞是一种非神经元细胞，存在于中枢神经系统中，在疾病发生中起着重要作用。

近日，德国吉森大学Sven Heiles课题组利用常压扫描微探针基质辅助激光解吸/电离质谱成像(AP-SMALDI MSI)研究了人源初始小胶质细胞和脂多糖(LPS)刺激小胶质样细胞的脂质组表型。

文中采用5µm-1.5µm空间分辨率，有效绘制了单个细胞的脂质组成图，从而能够区分不同细胞系和刺激条件，揭示初始细胞和LPS刺激细胞中的局部脂质异质性。采用此方法作者能够观察到单个细胞中甘油三酯(TG)水平升高，且这些富含TG的细胞数量随着LPS刺激而增加，这是促炎表型的标志。此外，作者观察到的特定磷脂酰肌醇(PI)的局部丰度变化，表明PI代谢的细胞特异性调节。

首先，作者研究了样品制备对脂质组覆盖、分布和细胞形态的影响。虽然用PFA固定的细胞很好地保留了细胞形态(图1a,b,f,g)，但快速冷冻的细胞的信号强度和脂质信号数量更高(图1c,d,h,i)。大部分强度较高的脂质信号不受样品固定的影响，表明PFA不会引起脂质组的重大变化(图1e, j)。正离子模式检测的主要是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和三酰甘油(TG)脂质，如[M+H]⁺、[M+Na]⁺、[M+K]⁺，或基质加合物，如[M+ DHB - H2O +H]⁺离子。在负离子模式下，磷脂酰肌醇(PIs)的[M-H]^-离子为主要信号。因此表明作者采用的方法能够覆盖大部分的脂质信号。

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Figure 1: The effect of sample preparation and laser spot size on the detection of lipids from iPSC-derived microglia-like cells. a,c,f,h: Microscopic images. b,d,g,i: AP-SMALDI MS images of PC 34:1 (m/z 896.6012) at 5 or 1.5 µm laser spot size. b: LPSstimulated MGL from the B8 cell line, 100x100 pixels, 5 µm pixel size (PFA fixation). d: LPS-stimulated MGL from the D9 cell line, 150x150 pixels, 5 µm pixel size (no fixation). g: Naïve MGL from the B8 cell line, 300x300 pixels, 1.5 µm pixel size (PFA fixation). i: Naïve MGL from the E2 cell line, 250x250 pixels, 1.5 µm pixel size (no fixation). e,j: Venn diagrams of individual lipid signals annotated to cells shown in b,d,g, and i, respectively, with fixation (green), without fixation (blue) or with both methods (cyan) for 5 µm (e) and 1.5 µm (j) measurements. Scale bars: 100 µm.

接下来，作者研究了在5µm分辨率下，基于正负离子模式的脂质信号来识别初始和LPS刺激的小胶质细胞系间异质性的能力。比较不同细胞系或同一细胞系初始和LPS刺激细胞的AP-SMALDI MSI结果时发现有些信号仅在一组中检测到，而其他信号在所有观察组中丰度相似(图2)。作者进一步采用主成分分析(Principal component analysis, PCA)对相同细胞系的数据进行分组(图2a、b)，并根据第1和第2主成分将其与其他细胞系分离。初始细胞和LPS刺激细胞(图2c和图S14)也相互分离，从而表明了根据AP-SMALDI MSI结果来区分细胞系或激活状态的可行性。

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Figure 2: Cell-line heterogeneity assessed by AP-SMALDI MSI. a-c: PCA of AP-SMALDI MSI results in positive-ion mode using an ANOVA-based multiple sample test. Three biological replicates of cell cultures grown in separate wells on the same glass slide, each containing a multitude of individual cells, were used for analysis and mass spectrometric signal intensities were averaged over 22,500 mass spectra. Significance of signals was evaluated using p-values of <0.01. a: Cell lines OX1 (red), D9 (green), C12 (blue) and E2 (black) in naïve state. b: Cell lines OX1 (red), D9 (green), C12 (blue) and E2 (black) in LPS-stimulated state. c: Naïve (blue) and LPS-stimulated (red) cells of the OX1 cell line. d: Violin plot of 252 TG-associated signal intensities at 5 µm pixel size for naïve (blue) and LPS-stimulated (red) OX1 cells averaged over all cells of the 3 biological replicates of the cell line. Black line indicates median. p-Value calculated by double-sided t-test. e: AP-SMALDI MS image of PC 34:1 (m/z 896.6140) of biological triplicate cell cultures grown in separated wells on the same slide of the OX1 cell line in naïve and LPS-stimulated state, respectively, at 5 µm pixel size, showing similar distributions for both conditions. f: AP-SMALDI MS image of DG O-38:8 (m/z 661.4593) of biological triplicate cell cultures grown in separated wells on the same slide of the OX1 cell line in naïve and LPS-stimulated state, respectively, at 5 µm pixel size, showing enrichment in LPS-stimulated cells. Scale bars: 500 µm.

作者研究了AP-SMALDI MSI在同一细胞系中鉴定异质化合物分布的能力。5µm、2µm和1.5µm分辨率条件下，PFA固定的B8细胞的成像结果如图3 a、c和e所示，相应的显微镜光学成像结果如图3b、d和f所示。随着分辨率的增加，细胞的胞体和突起等细胞特征可以通过细胞膜主要成分如PC 34:1(如图3中绿色部分)清晰的勾勒出。采用1.5µm像素大小的AP-SMALDI MSI成像的突起直径≈5µm，与光学图像中直径一致。这一结果也表明脂质在本文的样品制备过程中不会分散到基质中，体现了其精湛的样本制备工艺。

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Figure 3: Increasing lateral resolution enables the localization of discrete subcellular features by AP-SMALDI MSI. a: LPSstimulated MGL cells of the B8 cell line, 100x100 pixels, 5 µm pixel size. c: Naïve MGL cells of the B8 cell line, 250x250 pixels, 2 µm pixel size. e: Naïve MGL cells from the B8 cell line, 300x300 pixels, 1.5 µm pixel size. b,d,f: Corresponding microscopic images of the measured sample regions. a,c,e: Color-coding: red: TG 52:2 (m/z 881.7568), green: PC 34:1 (m/z 896.6140). Scale bars: 100 µm.

许多信号只存在于特定单细胞内，在同时培养的其他细胞中缺乏或强度降低(图3中红色代表TG 52:2相关离子)。该现象在LPS刺激的B8细胞中均可以观察到（图4）。当使用t-SNE降维方法对单个细胞上所有测量的像素点的质谱数据进行分析时，发现了两个簇（图4a中分别用绿色和红色表示）。在m/z 800以上的质量范围内，两个鉴定组(红绿簇，图4a)像素的质谱存在差异。将红色集群的空间分布(图4d)与TG 52:2对应的高变化信号的空间分布(图4c)进行比较，可以发现两幅图像几乎重合。这表明该方法能够局部解析TG含量升高的区域，最有可能是脂滴聚集的区域，它们进一步证明了该方法适用于研究细胞亚型间的异质性。

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Figure 4: AP-SMALDI MSI and statistical analysis for identification of LPS-stimulated B8 cells with increased TG production. a: Pixel-wise t-SNE analysis of mass spectrometric data (m/z 800-1000), where each of the 6511 datapoint relates to an individual mass spectrum. Off-cell signals were excluded from analysis. b: Example of single-pixel mass spectra corresponding to the red and green cluster as identified by pixel-based t-SNE analysis in a. Stars indicate matrix-related signals. c: AP-SMALDI MSI image with 100x100 pixels at 5 µm pixel size of LPS-stimulated PFA-fixed B8 cells. Color-coding: red: TG 52:2 (m/z 881.7568), green: PC 36:2 (m/z 808.5826). d: Pixel-wise classification based on t-SNE analysis of the mass spectrometric data with automated color-coding referring to clusters identified in a. Additional information in Figure S21. Scale bars: 100 µm.

除TG外，其他信号在细胞间存在异质性分布。在阴离子模式下，多种磷脂酰肌醇(PI)呈现局部不同强度分布。当AP-SMALDI MSI分析PI 38:X时，发现PI 38:4 (m/z 885.5498)在所有细胞中都有检测到(图5c, f)，PI 38:3 (m/z 887.5655)和PI 38:5 (m/z 883.5342)在不同的亚群中丰度较高(图5b, e和S24)。这种异质性可能与不同的小胶质细胞表型中存在的不同的去饱和酶活性有关。

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Figure 5: Degree of FA saturation differs between MGL cells. a,d: Microscopic image of the region investigated by AP-SMALDI MSI of naïve B8 MGL. b,c,d,e: AP-SMALDI MSI images acquired with 150x150 pixels at 5 µm pixel size (b,c) or 250x250 pixels at 2 µm pixel size (e,f) in negative-ion mode, showing in b,e the heterogeneity of PI 38:3 (m/z 887.5655, red) and PI 38:5 (m/z 883.5342, green) and in c,f the homogeneous distribution of PI 38:4 (m/z 885.5499, greyscale). Scale bars: 100 µm.

总结

本文使用高分辨AP-SMALDI MSI(分辨率达1.5µm)分析玻片上培养的固定或快速冷冻的人源小胶质细胞，可视化单细胞的脂质异质性。此外，该方法能够识别同一细胞系中单细胞之间(如LD)或细胞内(如PI物种)的异质性，表明小胶质细胞会分化成不同的表型。一方面，作者观察到亚细胞炎症诱导的异质性通过脂滴形成表达，这是首次报道通过MSI显示亚细胞特征中的完整生物分子，结果与荧光显微镜和文献报道一致。由于LPS触发小胶质细胞的炎症反应机制，这种异质性在LPS刺激的样本中更加明显。另一方面，在正离子和负离子模式下，影响完整细胞体的单细胞异质性被发现，这一点在检测PI脂质物种的负离子模式中尤其突出。这些发现表明先进的MSI技术可以区分培养中的单细胞的脂质组表型，结合其他单细胞分析方法，可以绘制细胞脂质组甚至亚细胞组成的异质性，这将有助于进一步了解细胞特异性脂质代谢。

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