全方位解析新版美国药典《mRNA 疫苗质量分析方法-指南草案》中的微孔板检测项目

“2023 版草案”中的质粒 DNA 放行检测及 mRNA 药物的原料药表征和放行检测中均提到了 UV 法对质粒 DNA 及 RNA 进行浓度测定，UV 法的优势是操作简便，无需额外的试剂。

检测原理：核酸的嘌呤和嘧啶环含有共轭双键，在 260 nm 左右的紫外光有较强的吸收；根据 Beer - Lambert 方程，通过测量 260 nm 的吸光值可计算出 DNA、RNA、寡聚核苷酸的浓度。

260/280 的比值用于评估样品的纯度，纯的 DNA A260/280 比值为 1.8，纯的 RNA A260/280 比值为 2.0，样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280 比值即明显降低。

应用方案 1：使用高通量微量检测板（例如 Take3 板）配合多功能酶标仪，可开展多通量体积低至 2 μL 的核酸定量检测，检测限低达 2 ng/μL。

应用方案 2：采用 96 或 384 体系的 UV 可透过微孔板，配合多功能酶标仪，进行高通量核酸定量检测。这个方案相对于微量检测板，样本消耗量较大，但通量更高。并且需要仪器软件带有自动光程矫正的算法。

mRNA 疫苗整个生命周期的生产流程中，有多项残留项目检测，包括质粒 DNA 放行阶段的宿主细胞残留检测、卡那霉素残留检测；mRNA 原料阶段的 dsRNA 检测、T7 聚合酶检测等，这些检测项目的共同点都是采用经典的酶联免疫吸附法（ELISA）进行测定。

ELISA 的检测原理：ELISA 可以说是一种历史悠久，使用场景极为丰富的检测方法，核心原理是抗原与抗体免疫学反应，具有特异性。将一定浓度的抗原或者抗体通过物理吸附的方法固定于微孔板表面，加入待检标本，通过酶标物显色的深浅间接反映被测物的浓度，由于酶标记可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，使 ELISA 具有很高的敏感性。

ELISA 的实验设计有很多，主要包括间接法、 双抗原/抗体夹心法和抗原竞争法等，根据待测物的特点选择其合适的 ELISA 方法，例如 2023 指南中涉及的几种检测项目：

包封率是 mRNA 载药体非常关键的指标，表示包裹在脂质纳米颗粒内部的 RNA 占全部 RNA 的比例，是确定 LNP 药物制剂精确给药剂量的基础，这个指标广泛应用于 LNP 早期开发及后期生产质控中。

包封率的测定方法：2023 版草案推荐采用基于 RiboGreen 的荧光检测。其原理是：当 RiboGreen 特异性插入核酸后，能够发出绿色荧光，可用于定量溶液中的 RNA，检测下限可以低至 1 ng/ml，使用 96 孔板检测时，每孔 200 uL 样品中可以检测到 200 pg RNA，并且具有特异性好，线性范围宽等优势。

主要检测流程：包括 buffer 和 LNP 样本制备、 96 孔板样本及标准品加样、加入 triton 孵育破乳、加入 RiboGreen 试剂（以上和各种液体孔板打交道的工作，都可以交给自动化移液工作站完成，比如安捷伦的 Bravo），最终送入BioTek Synergy 高通量酶标仪，调取现有方案，一键开始荧光强度读数，最快只需数十秒即可完成检测。

Gen5 软件可实现 LNP 包封率检测程序设置、板布局、原始数据及数据分析一站式方案

在 2023 版草案中，对于 mRNA 原料和 mRNA 制剂推荐采用 Cell-based assay 评价 mRNA 疫苗的效力，相对于传统的动物实验，这种体外细胞学水平的评价经济快捷，标准化程度高，并且非常适合开展高通量自动化操作。

主要检测原理：通过对 mRNA 及 mRNA-LNP 转染细胞中表达蛋白的功能结合试验，可以证明 mRNA-LNP 的效力（以确认 mRNA 分子的完整性，并证明表达蛋白的关键表位）。对于特定产品的 mRNA 编码蛋白的评价可以通过 ELISA 法，检测细胞水平的蛋白表达，以及表达蛋白的结合功能评价。

USP 指南中使用 HepG2 细胞进行细胞表达，可以使用其他细胞系或方法。

内毒素/酯多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁外膜外侧的一种结构成分，被发现广泛分布，覆盖约 75% 外膜表面。可触发高热、败血性休克等严重的生理反应，对于药品放行，内毒素是必检项目。在 mRNA 疫苗生产流程中多项环节都有此检测项目，2023 版草案中推荐的内毒素检测方法是参考 USP <85> 中的鲎试剂检测法（中国药典（ChP）1143 细菌内毒素检查法同样是鲎试剂法），其中包括三种类型的检测方法：

另外，目前基于重组 c 因子的内毒素检测方法也越来越多受到关注，关于内毒素的详细应用案例，我们后续会有专题报道。

上图：细菌内毒素检测鲎试剂法的主要检测原理

 最后，整体推荐方案时间到 

USP 疫苗质量控制指导原则中，推荐使用 Cell-based assay 开展 mRNA 原液和制剂的放行检测，其中涉及大量细胞铺板、洗板、孵育和检测的步骤，BioSpa8 平台可根据客户需要灵活搭建自动化的细胞检测平台。