“菌”说丨LESA-MS 在放线菌表面直接筛选抗生素

2023-07-21 18:23:20, 华质菌华质泰科生物技术（北京）有限公司

抗生素已成为人类健康必不可少的药物。但随着致病菌耐药性的增加，我们需要不断寻找新的抗生素。

放线菌类能够产生天然的抑制革兰氏阳性菌生长的抗生素。若在放线菌的生态领地内，有其他微生物存在，放线菌会感应到其他微生物产生的信号分子，并产生抗生素与之对抗。科学家通过改变放线菌的营养和生长环境（pH 值，温度，共生菌株等），来刺激各种新型抗生素的产生。

通常，筛选的抗生素的方式包括提取、色谱分离和天然产物质谱分析以及其他结构分析方法，但获得新的抗生素线索稍显有限。我们需要一种快速，灵敏且经济有效的筛选方法，以从不同培养条件的细菌中成功鉴定出新的抗生素。

为此，德国马克思·普朗克化学生态研究所 Aleš Svatoš 课题组，以液滴萃取表面分析(LESA)、基于芯片的多通道纳升电喷雾离子化技术和高分辨质谱或串联质谱联用作为筛选平台进行检测。以放线菌为研究对象，不同培养条件，使用溶剂从培养基上的菌落表面直接提取抗生素，并进行质谱（MS）分析。

LESA-MS 能在细菌表面直接提取抗生素，使整个筛选和鉴定过程变得简单、快速和高效。不仅能自动化地完成提取，纳喷注射和高通量的质谱分析，而且每做一个样品，能够自动更换枪头和纳喷孔道，避免了交叉污染的风险。

细菌的液滴萃取表面分析（LESA），简化了细菌样品的制备，建立快速筛选流程。

培养菌株：非链霉菌分离株 F-169.583，链霉菌 F-179.539，支原体菌株 F-136.425；粘附细菌菌丝的培养皿表面，剃须刀裁剪大小，适应 LESA 平台尺寸。

溶剂：含有0.1%甲酸的乙酸乙酯/丙酮混合溶剂（65:35，v/v），LESA 直接液滴萃取培养皿表面，自动化移至芯片喷嘴，纳喷离子化。

正离子模式下，在 LTQ-OrbitrapXL 质谱仪上进行 MS 分析，毛细管温度和毛细管电压分别设置275℃，35V，得到全扫描质谱图，并进行聚类分析。

图1、非链霉菌分离株 F-169.583中产生多硫霉素及其钠加合峰

图2、地中海拟无枝菌酸菌 F-136.425中产生的抗生素 Thioplabin A 和 Thioplabin B 及 Thioplabin A 的钠钾加合峰

图3、链霉菌 F-179.539 的质谱图，放大的红色方框中的峰表示，质子化的抗生素10381Z2（m/z 1201.3032），链霉素和去甲氧链霉素及其钠加合峰。

图4、抗生素 Thioplabin A 的 MS²质谱图

研究证明，LESA 与高分辨率质谱联用是从不同放线菌中提取和检测噻唑基肽类抗生素的有力工具，为筛选和表征抗生素提供了一种快速简便的方法。

LESA 可直接从细菌表面检测抗生素，并能回答有关细菌信号分子的问题。该方案的开发和聚类分析，可用于高通量快速筛选在实验室条件下人工培养基或天然底物上生长的细菌菌株，真菌和其他微生物。

LESA 液滴萃取表面分析-视频案例演示

● 参考文献

Marco Kai, Ignacio González, Olga Genilloud, Sheo B. Singh and Aleš Svatoš. Direct mass spectrometric screening of antibiotics from bacterial surfaces using liquid extraction surface analysis, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2012, 26, 2477-2482

关于液滴萃取表面分析 LESA

LESA 多通道纳喷离子源利用机器人抓取、转移和连接样品与刻蚀于芯片上的400个高度重现的独立喷针，进行全自动的纳升电喷雾质谱分析，实现其他纳喷质谱或常规液质不能实现的功能：

（1）纳升级注射全自动电喷雾直接进样，无需清洗，自动分析达400个样品；零残留、高灵敏度。适于活性物质或代谢物及毒性成分的鉴定解析；对组学分析、ADCs 抗体药物偶联物、非共作用研究特效。

（2）馏分收集，以信号累加方式鉴定复杂基质中的痕量未知物。

（3）在线 nanoLC-MS 接口，可自动感应喷雾电流和堵塞，3秒自动移换喷头，实现无人值守的连续分析，保障超长时间 nanoLC-MS 分析的连贯性、重复性。

（4）表面轮廓分析，以一滴溶剂在中药切片、生物体组织、培养皿、药材、薄层板、MALDI 板等特定表面进行1秒的微萃取，纳升电喷雾质谱检测，实现分子成像和或分布轮廓分析（0.4毫米空间分辨率）。

（5）可升级为 LESA Plus，液滴萃取后，通过六通阀切换萃取液至纳升或微升柱，分离后再纳喷质谱检测。LESA兼容主流质谱厂商（Agilent、SCIEX、ThermoFisher、Waters、Bruker、Shimadzu）各类型质谱仪如 FTMS、Orbi、飞行时间、离子阱、三重四极杆及混联质谱。

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TriVersa NanoMate 多通道纳喷源 Q&A 第1期