RP-HPLC中的离液剂：原理与应用

根据统计，超过半数的药物分子含有碱性官能团。在常用的中性和酸性条件下，这些碱性基团一般以带正电荷的状态存在，亲水性增强，疏水保留减弱，同时由于存在与常用的硅胶基质的色谱柱上残留硅羟基的强的次级作用（如离子交换等），因此可能带来峰型的问题。

解决碱性化合物的保留和峰型问题的方法有很多，除了使用特殊的色谱柱（比如带有电荷的色谱柱），离子对方法也被广泛使用，也就是通过引入电荷的方式解决因为电荷带来的问题。其中最常见的为亲脂性的离子对试剂，如烷基磺酸类或者烷基铵类等，这种也被称为传统的离子对试剂，这类离子对试剂会吸附在色谱柱固定相上从而对色谱柱造成不可逆的改性，也就是让色谱柱带上了离子交换的性能，因此建议专柱专用。除了这类离子对试剂，还有一类试剂叫离液剂（Chaotropic Reagent），当恰当地使用这些试剂也可以明显增强碱性化合物的保留并改善峰型，同时并不会对色谱柱造成改性，而且具有更好的梯度方法重现性，正是由于离液剂具有这些优势，因此受到了越来越多的关注和应用。本文将系统总结一下离液剂的概念、作用原理和影响因素，并分享我们星谱实验室做的应用。

什么是离液剂？

1888年，捷克的科学家霍夫梅斯特（Hofmeister）发现了一个与蛋白质变性剂有关的规律。他发现不同的盐让蛋白变性的能力不同，有些盐如硫氰化钠(NaSCN)只需要加一点就可以让蛋白质变性，而有些盐则需要加很多才能起效，甚至达到最大溶解度时也不能使蛋白质变性，比如NaCl。霍夫梅斯特就按照让蛋白变性时的浓度大小排序，这就是著名的霍夫梅斯特序列（Hofmeister Series），他发现的序列是这样：对于阴离子：SO₄^2-> Cl^- > NO₃^-> Br^- > I^-> ClO₄^- > SCN^-，这些容易让蛋白变性的阴离子就被称为离液阴离子（Chaotropic anion）,对于阳离子：NH₄⁺>K⁺>Na⁺>Li⁺>Mg²⁺>Ca²⁺>guanidinium。对于纯化学背景的人来说，离液剂这个名词可能会比较艰涩难懂，但是对于其英文反而觉得更容易理解（“chao-trope” = disorder maker），我猜测这个词的当年的翻译者是基于这类试剂可以让蛋白变性，从而让蛋白从溶液里的均相状态析出而脱离溶液状态这种现象翻译而成，希望可以帮助大家理解。

图1. 霍夫梅斯特序列

整整110年后，也就是1998年，诺华的科学家LoBrutto和西东大学的Kazakevich教授在第22届高效液相分离和相关技术国际论坛上首次分享了离液阴离子对分析物保留的影响。从而让这类试剂多了一个液相色谱的应用领域而引发更多的关注。从离液剂的化学结构可以看出，它们具有高度的电荷离域、大的可极化率以及低的水合性。在色谱中常用的流动相添加剂中，阴离子的离液能力排序为：

PO₄^3-< SO₄^2-< H₂PO₄^-< HCOO^- < CH₃SO₃^- < Cl^- < NO₃^- < CF₃COO^- < BF₄^-< ClO₄^- < PF₆^-。

离液剂的作用原理

离液剂在反相色谱中的作用机理比较复杂，可以总结成三种作用：

1. 离子对作用：离液剂阴离子会和传统的离子对试剂一样与分析物阳离子形成中性的离子对疏水性增强，从而增强在反相色谱中的疏水保留；

2. 离液作用：离液剂阴离子会打破分析物的溶剂化层，因此增加分析物的疏水性保留。我们知道当离子型化合物溶解在水中时，会解离成阴离子和阳离子，而这些离子并不会孤立存在，而是会与周围的水分子发生作用，从而被“溶剂化”，也就是在这些离子的周围就会紧密包围一些溶剂分子，从而形成一种更有序的状态，如下图即为NaF溶解在水中后的两种离子的水合层示意图。对于碱性化合物也是类似的情况，在流动相中发生电离时，也会被水分子溶剂化，从而让其亲水性增强，在反相色谱中保留减弱。

图2. 阴离子和阳离子及其水合壳层示意图

而离液剂阴离子可以通过破坏水的氢键，从而改变水的结构，让水分子变得更加无序，因此碱性分析物的溶剂化层会由于离液剂阴离子的存在而被破坏，也就是降低其溶剂化，从而增强其在反相里的疏水保留。

3. 亲脂作用：离液剂阴离子由于亲脂性比较强，会吸附在固定相的表面，从而与原色谱柱的固定相形成“准固定相（pseudo-stationary phase）”，因此在原来疏水的固定相上引入了带电的成分，也就引入了与分析物的电荷作用。

所有的三种机理都可能在实际情况下共存，但哪种占据主导就取决于洗脱液的类型、组成和固定相的表面性质。

反相色谱中使用离液剂时的影响要素

1. 离液剂的种类

正如上所提到的霍夫梅斯特序列所提到的，不同的阴离子的离液能力不同，因此当添加同样摩尔浓度的不同离液剂时，对碱性化合物的保留的影响也会不一样。如下图所示，可以看到在很大的浓度区间内，离液能力越强，同样浓度下对保留的增强也越明显。

图3. 使用不同的离液剂时不同浓度下醋丁洛尔的保留因子变化

因此，当使用不同的离液剂时，所需的浓度也会不同，其让完全质子化的分析物所达到的反相保留极限也不同。图4为9种阴离子对三种胺的保留时间增强的排名图：

图4. 不同的离液剂对三种胺（nordexepin，nortriptyline和amitriptyline）的保留增强效应排序

2. 离液剂的浓度

当离液阴离子的浓度增加时，质子化的碱性分析物的被水包围的溶剂化层逐渐被打破，溶剂化程度降低，从而其疏水性增强，从而在疏水的固定相上的保留就增强（如图5所示），同时由于分析物的正电荷被离液剂阴离子分散，降低了正电荷所带来的次级作用，因此也可以改善峰型（如图6所示）。

图5. 使用不同的离液剂时不同浓度下醋丁洛尔的保留因子变化

图6. 不同浓度的PF₆^-对分析物的保留、柱效和拖尾因子的影响（色谱条件：C8柱，0.1%（v/v）磷酸+xPF₆^-[1-25mM] : ACN = 90 : 10，1mL/min，25℃，254nm）

但是从逻辑上讲，当离液阴离子的浓度很高时，几乎所有的溶剂化层都会被打破，这样继续增加离液剂浓度也不会让保留时间增加，也就是会存在“饱和效应”。如图7所示：

图7. 使用不同浓度的几种离液剂时3,4-二甲基吡啶的保留因子变化

3. 流动相中有机相的类型和比例

3.1 有机相的类型

在RP-HPLC中，有机相的类型经常可以影响选择性，而在添加离液剂的RP-HPLC中，有机相如甲醇、乙腈的影响甚至更加明显。如前面分析离液剂的机理提到，离液剂会吸附在固定相的表面，从而形成“准固定相（pseudo-stationary phase）”，从而让固定相带有了电荷，可以与带正电荷的分析物发生电荷作用。因此，离液剂在固定相上的吸附量也会影响带正电荷的分析物的保留。

研究表明，甲醇与乙腈在反相固定相表面的吸附存在很大的差异。乙腈分子在固定相表面可以形成薄层（14Å左右），但甲醇分子只能在固定相表面形成单分子层（2.5Å左右）。2001年Kazakevich等研究不同有机溶剂（甲醇，乙腈和四氢呋喃）在不同碳链长度的烷基键合硅胶上的吸附层厚度，如图8所示：

图8. MeOH、ACN和THF在不同碳链长度的硅胶键合烷基相上的吸附层厚度

由于离液剂需要通过以有机相为媒介附着在固定相上，因此当使用乙腈时离液剂可以更多明显的附着在固定相上，从而更加明显地改变固定相的带电情况。因此当使用甲醇和乙腈时可能会体现更明显的选择性差异，但具体到使用哪种溶剂保留更强，还需要综合两者的疏水洗脱强度。

3.2 有机相的比例

有机相的比例也会影响离液剂离子在固定相上的保留量。如下图7所示在乙腈/水的流动相体系中，当为100%水时，三种离液剂离子都有一定的保留，当乙腈浓度增加时，所有的离子的保留都有显著的增强，当流动相约为10%乙腈时，所有的离子达到最大的保留，其中PF₆^-最为明显。当继续增加有机相时，所有的离子的保留变弱。而当在甲醇/水的流动相体系中时，所有离子的保留都是随着甲醇比例的提高而减弱。

图9. 在乙腈-水体系和甲醇-水体系三种阴离子在C18上的保留曲线

这可能和带有高度离域的电荷和极化率的离子与固定相表面吸附的高度有机相之间的作用有关。比如，乙腈分子带有四个π电子，因此会与PF₆^-等形成明显的π-π作用。而甲醇分子主要作为弱的氢键供体（Hydrogen donors），并不能产生如此强的作用。

因此，我们可以看到，相比一般的反相色谱，当添加离液剂时，有机相的类型和浓度的影响会更加微妙，因为它们会影响离液剂在固定相上的吸附，从而影响保留机理。

4. 流动相的pH

在RP-HPLC中，对于可电离的化合物，流动相的pH会影响其电离状态从而改变其疏水性，进而影响其保留。在碱性化合物的反相分析中，当考虑用离子对方法时，需要确保化合物处于完全的质子化，也就是充分带上正电荷，这样才能和离液剂阴离子充分作用。在满足这个要求下，离液效应和pH关系不大。由于很多离液阴离子（如高氯酸根离子、六氟磷酸根离子等）本身是强电解质，因此本身并无缓冲能力，因此经常需要和其他常用的缓冲盐一起使用，以确保分析物充分电离。

5. 离子强度

如上面的“流动相的pH”提到，很多情况下离液剂需要和其他缓冲剂一起使用，如使用KPF₆作为离液剂时，常常基于对特定pH的需要使用磷酸盐或者醋酸盐等。当加入其他缓冲剂时，会直接影响流动相中的离子强度。Kazakevich等在研究离液剂离子在固定相上的保留行为时发现在当流动相为纯水-有机溶剂，而不添加其他缓冲剂时，这些离液离子的保留时间很不稳定，重现性很差，在有些情况下，所有的离子会在死时间之前出峰，也就是体现出离子排阻的作用。而提高离子强度，即使只有1mM，也让所有研究的离液剂离子具有稳定的保留重现性。如图10为PF₆^-在不同的有机相比例、在不同的离子强度时在C18上的保留曲线图：

图10. PF₆^-在不同的有机相比例、在不同的离子强度时在C18上的保留

从图10可以看到PF₆^-在随着离子强度的增加而保留，这也可以用离液理论来解释。也就是随着实验中的抗衡离子（NH₄⁺）浓度增加时，也会破坏PF₆^-的“溶剂化”，从而增强其保留，这些数据也为我们设计流动相时提供一些参考。但需要注意的是，在保持离液剂浓度一定时，增加离子强度是否能增强保留还需要综合考虑其他因素，比如是否存在离子交换作用等等。

本文聚焦于RP-HPLC中用到的离液剂（Chaotropic Reagent），针对其基本概念、作用原理以及使用过程中的影响因素进行展开论述，希望能为用户朋友在用反相色谱分析带正电荷化合物时提供思路和优化方法的方向。

1. 主要参考资料
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1. R. LoBrutto, Y.V. Kazakevich, Advances in CHROMATOGRAPHY, Chapt 7, 2005, CRC Press;

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3.科学网：物理化学史上的一颗明珠——霍夫梅斯特序列(Hofmeister Series)（https://blog.sciencenet.cn/blog-38740-590946.html）;

4. Y.V. Kazakevich, R. LoBrutto, F. Chan, T. Patel, J. Chromatogr. A 913, 2001, 75;

5. T. Cecchi, P. Passamonti J. Chromatogr. A 1216, 2009, 1789；

6. Y.V. Kazakevich, R. LoBrutto, R. Vivilecchia J. Chromatogr. A 1064, 2005, 9；

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8. L. Pan, R. LoBruttoa, Y.V. Kazakevich, R. Thompson J. Chromatogr. A 1049, 2004, 63；

9. J.M. Roberts, A.R. Diaz, D.T. Fortin, J.M. Friedle,  S.D. Piper, Anal. Chem. 74, 2002, 4927.

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