Cell Death & Disease（IF 9.7）| 转录组+5D蛋白质组学助力国内团队类器官模型评价及药物筛选

皮肤和软组织感染是住院患者发病率和死亡率的一个重要原因。早期诊断、选择合适的抗菌剂和及时的手术干预是治疗成功的关键。因此，迫切需要建立合适的抗菌药物筛选模型。传统的2D表皮细胞并不能包覆人体表皮的体内细胞组成和生理结构，抗菌药物筛选的结果与体内结果存在差异。而类器官已被证明是研究传染性疾病和人类特异性感染原的一个很好的模型。

复旦大学和中国医药工业研究总院的研究团队合作，构建了一种皮肤类器官模型，通过形态学检测、生化表征及转录组RNA测序和5D蛋白质组学明确了其与来源皮肤组织的高度相似性。最后，基于该类器官模型进行了抗药性金黄色葡萄球菌药物的筛选。研究成果以“Use of mouse primary epidermal organoids for USA300 infection modeling and drug screening”为题，发表在Cell Death & Disease（IF：9.685 ）上。

作者从新生小鼠的皮肤组织中分离表皮细胞，并参考已报道的文献构建了小鼠初级表皮类器官（mPEO）。类器官的直径随着培养天数的增加而增加，最终产生了一个含有角质化内核的200-300μm的结构。类器官的数量也逐渐增加。

接下来，作者就类器官的特征进行了分析。HE染色的形态分析显示，在类器官结构中心可见大的扁平基底样细胞和硬化的角化物质。透射电镜进一步证实了类器官的多层表型，其结构包括一层基底细胞(SB)、一层短小的柱状基底细胞、棘层（SP）、4-10层多边形的，较大的棘细胞、3-5层扁平的纺锤形细胞以及角质层(SC)。SB位于类器官的外部，SP、GR和SC位于类器官的中心。

免疫荧光染色表明，mPEO表达多种皮肤特异性生物标志物：颗粒层标记物Loricrin、棘层标记物Involucrin和 Cytokeratin-10 (KRT10+)、基底层标志物Cytokeratin-5 (KRT5+)、Cytokeratin-14 (KRT14+)和Cytokeratin-15 (KRT15+)、复杂上皮细胞类型标志物Cytokeratin-17 (KRT17+)和Pancytokeratin(AE13+)以及增殖相关标志物Ki67+。接下来，作者对mPEO的石蜡切片进行免疫组化染色。结果发现颗粒层标志物Loricrin和棘层标志物Involucrin和Cytokeratin-10（KRT10）在类器官中心具有很强的免疫活性。此外，基底层标志物KRT14和增殖相关标志物Ki67呈阳性。总之，以上这些数据表明，mPEO作为小鼠初级皮肤组织来源的表皮类器官，分化良好，具有与哺乳动物皮肤类似的多层表皮结构。

为了评估mPEO与皮肤组织的相似性，作者比较了它们的转录组数据。Venn分析显示mPEO与皮肤组织之间有23692个相同基因。差异基因数为6429个，其中5622个差异不显著(p > 0.05)。三组mPEO与其来源皮肤组织的皮尔森相关性系数值分别为0.88、0.88和0.87。GO富集分析显示，类器官和来源皮肤组织在生物过程、细胞组分和分子功能方面相同的基因比例分别为4937/5655、568/640和791/922。GO-生物过程富集分析结果表明，mPEO基因主要富集于角质形成细胞增殖、表皮发育和表皮细胞分化等皮肤发育过程，以及皮肤屏障建立、上皮细胞极性、皮肤形态发生和伤口愈合等皮肤生理功能。与皮肤发育相关的信号通路包括经典和非经典Wnt信号通路、EGFR和TGFβ受体。细胞组分分析显示mPEO中存在桥粒、半桥粒和角蛋白纤维。此外，涉及表皮发育、表皮分化、皮肤屏障建立的关键标志物基因以及基底膜、SC、SB、GR和SP特异性基因在mPEO与来源皮肤组织之间的表达情况高度一致。

同样地，作者利用5D蛋白质组学技术评估了mPEO与其来源皮肤组织间在蛋白质组学层面上的相似性。结果显示，皮肤组织和mPEO分别定量了4822和5304个蛋白，其中有5353个没有显著性差异（p>0.05），774个有显著性差异（p<0.05）。三组mPEO与其来源皮肤组织的皮尔森相关性系数值分别为0.77、0.79和0.69。GO富集分析显示，类器官和来源皮肤组织在生物过程、细胞组分和分子功能方面相同的基因比例分别为6156/6258、741/747和1107/1166。mPEO中鉴定到的蛋白质参与了上皮细胞增殖、表皮发育、表皮细胞分化、伤口愈合和建立皮肤屏障等生物学过程。细胞组分分析显示mPEO中存在包含桥粒、半桥粒和角蛋白纤维。作者比较了参与基底膜、表皮发育、角蛋白、表皮分化、SC/SB/GR/SP特异性和皮肤屏障建立等过程的蛋白质的表达强度在mPEO与来源皮肤组织之间的差异，发现大多数没有显著差异。

接下来，作者评估了mPEO在构建皮肤病，特别是感染模型方面的可行性。作者选择了USA300，这是一种常见的、难治性的抗甲氧西林金黄色葡萄球菌，常见于皮肤和软组织感染。感染实验表明，在2、4、8和24h内，mPEO上的USA300菌落数量增加。与正常类器官相比，感染了细菌的mPEO在2h和4 h表现为鳞状上皮细胞核增大和核坏死。感染后24 h，mPEO结构空心化。在2、4、8和24 h，7-ADD+细胞比例分别为24.7%、29.7%、62.0%和70.3%，表明细胞死亡数量增加。以上结果表明，mPEO具有模拟传染病的潜力，USA300可以定植和入侵类器官，同时降低mPEO的细胞活力。

作者进一步研究了USA300在mPEO上的定植过程。作者发现金黄色葡萄球菌主要定植于类器官的外围，在2和4 h与基底层标志物KRT14共存。在8和24 h时，类器官外周细胞死亡，金黄色葡萄球菌侵入类器官内部，并与KRT14和棘层标志物Involucrin和KRT10共存。此外，作者发现在mPEO的细菌定植区域存在细胞焦亡标志物（cleaved-caspase-1 p10亚基）、自噬标志物（LC3-II）的积累。而细胞凋亡标志物（Cleaved-caspase-3）也在被感染的mPEO上被检测到，但大部分未与USA300共定位。总之，在感染过程中，USA300诱导mPEO定植和入侵位点的细胞焦亡和自噬，以及其他位点的细胞凋亡。

自噬降解限制了细胞焦亡和IL-1β的产生，这将保护USA300，避免其遭受角质形成细胞介导的清除。IL-1β水平的检测显示，与对照组相比，IL-1β在感染2、4和8 h显著上调，在24 h表达下降。作者推测mPEO通过细胞焦亡释放包括IL-1β在内的炎症因子来清除USA300。反过来，USA300也可能通过诱导mPEO的自噬、促进炎症小体的降解，从而逃避角质形成细胞介导的清除，最终实现在mPEO中的定植。

接下来，作者对3种利用mPEO感染模型进行药物检测的方法进行了评估。

方法A：USA300感染MOI=10的mPEO，使用指定浓度的药物处理24h，最后用CellTiter-Lumi™ 发光法细胞活力检测试剂盒检测mPEO的活力；

方法B：在A方法基础上，药物处理24h以后，弃去培养液上清，并用基础培养液润洗，以排除细菌裂解物对细胞活力检测试剂盒准确性的影响；

方法C：mPEO与USA300共培养24h后，洗去细菌，重新加入5% Matrigel（基底膜基质），并用指定浓度的药物处理24h，最后用CellTiter-Lumi™ 发光法细胞活力检测试剂盒检测mPEO的活力。

作者用以上三种方法测试了甲氧西林（methicillin）和万古霉素（vancomycin）的抑菌作用。结果显示，方法B中，甲氧西林无法逆转细胞死亡，而万古霉素可以恢复细胞活力，且具有浓度依赖性。方法A和方法C的对照组和感染组无显著差异，作者认为方法的准确性低。在实验难度和成本上，方法C>B>A。综合考虑以上结果、实验难度和成本，作者认为方法B是用mPEO感染模型进行药物敏感度检测的最合适的方法。

方法B中，实验后感染的mPEO中细胞活力显著下降，而在万古霉素（vancomycin）处理后，细胞活性恢复。同时，实验还发现甲氧西林（methicillin）不影响USA300在mPEO中的内化，而万古霉素（vancomycin）可以以一种浓度依赖性的方式降低USA300的内化。

本研究，作者构建了小鼠初级表皮类器官(mPEO)模型，并明确mPEO具有表皮分层的组织学和形态学特征。转录组mRNA测序和5D蛋白质组学检测发现，其mRNA和蛋白质表达模式与与其来源皮肤组织高度相似。在mPEO对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌USA300感染的敏感性实验中，结果表明mPEO支持USA300的定植和入侵，USA300诱导mPEO发生细胞焦亡和自噬。最后，作者使用mPEO感染模型进行了药物筛选，结果表明万古霉素能以浓度依赖的方式恢复细胞活力并抑制细菌内化。总体，作者建立了一个体外皮肤感染模型，这将有助于药物筛选策略开发和抗菌药物机制研究。

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