异体细胞治疗 – 利用单细胞多功能蛋白组技术监测细胞质量和预测疗效

自2017年FDA首次批准以来，被称为CAR-T疗法的嵌合抗原受体（CAR）T细胞已经改变了被诊断为血液恶性肿瘤患者的治疗格局。细胞治疗产品分为自体细胞和异体细胞两类。自体细胞是直接从病人自身的细胞中提取的。虽然自体CAR-T细胞减少了免疫排斥的风险，但它需要一个苛刻和漫长的制造过程。除此之外，它也极度依赖病人T细胞的功能适配性，而这种功能适配性往往因疾病或以前的治疗方法而降低。为此，凯特（吉利德科学旗下公司）1、CAR-T 之父Carl June以及耶鲁大学生物医学工程系的樊荣教授团队2各自利用PhenomeX单细胞蛋白质组学技术在细胞治疗前，监测细胞多功能强度3来预测细胞治疗疗效和不良反应如细胞因子风暴4，并证明它是评估CAR-T产品功能的有力工具。

尽管如此，研究人员仍在努力完善这些疗法，以减少不良反应和提高疗效。这包括利用异体免疫细胞制成“现成的”CAR-T产品为潜在的一种替代方案。现成异体CAR-T从健康捐赠者的细胞开始，不但可以减轻病人的负担，减少治疗延误，也可以被进行多种修改和CAR组合，以针对多种肿瘤抗原，避免肿瘤逃逸。虽然有希望，但这种方法确实困难重重，包括较高的排斥风险和缺乏经批准的治疗方法。为了优化CAR-T产品并降低排斥反应的风险，科学家研究了几种不同的方法。传统的基因组编辑技术使用诱导双链断裂（DSB）的核酸酶，可能产生潜在的难以预测的编辑效果，而且可能存在脱靶效应。较新的基因组编辑技术利用了胞嘧啶碱基编辑器（CBE），它可以产生点突变并抑制碱基切除修复，从而使基因组编辑更加精确。虽然这种技术很有前景，但CBE在细胞治疗领域的使用仍然是全新的，在用于细胞治疗之前必须经过临床验证。此时，研究人员可以利用已被证明是评估CAR-T产品功能的有力工具——单细胞蛋白质组学来评估细胞疗法中CBE的效果。

在最近发表在《Blood》上的一项研究5中，研究人员测试了CBE创建用于治疗复发/难治性T细胞急性淋巴细胞白血病（r/r T-ALL）的异体CAR-T产品的效用。这种类型的白血病很难治疗，因为它对化疗反应不佳，而自体CAR-T产品可能已经受到癌细胞的影响。在这项研究中，研究人员利用CBE开发了一种首例针对CD7（一种与T-ALL相关的细胞表面受体）的四倍碱基编辑的异体CAR-T。

由于PD1信号是抑制性的，并会削弱了T细胞的活性，于是作者首先探讨了抑制PD1的表达是否能改善细胞功能。利用来自两个捐赠者的细胞，研究人员创建了7CAR8，一种四重编辑的CAR-T，分别有和没有PD1表达，并在24孔板中用重组人CD7蛋白包板，培养7CAR8细胞。接下来他们使用PhenomeX的单细胞分泌组平台来评估工程细胞的功能表型。研究人员发现，PD1基因敲除增加了一个供体中7CAR8细胞的多功能性，即一个细胞同时分泌两种或以上的细胞因子的能力。但是另一个供体却没有。由于多功能性先前已被证明与临床结果和CAR-T效力有关，研究人员决定将PDCD1抑制编辑纳入随后的7CAR8产品进行体内测试。进一步的实验表明，7CAR8细胞具有抗肿瘤作用，并显著提高了T-ALL小鼠模型的生存率。

除了创建可以针对各种肿瘤抗原的安全的异体免疫细胞，每个病人对T细胞的高剂量需求和病人数量的增加导致了临床对大量异体T细胞的需求。因此，我们需要在扩大制造规模的同时也保持细胞质量。在发表于《Frontiers in Medical Technology》的文献里，Lonza利用PhenomeX的技术评估在搅拌罐生物反应器中扩增后的T细胞功能状态6。他们通过IsoLight平台和IsoCode单细胞多重因子芯片分析了CD4和CD8T细胞的单细胞功能谱--效应型（颗粒酶B、IFN-g、MIP-1a、Perforin、TNF-a、TNF-b），刺激性（GM-CSF、IL-2、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-12、IL-15和IL-21），调节性（IL-4、IL-10、IL-13、IL-22、TGF-b1，sCD137和sCD40L），趋化性或趋化因子（CCL-11、IP-10、MIP-1b，和RANTES）和炎症性（IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-17F、MCP-1和MCP-4）因子组。然后用IsoSpeak软件自动将多功能细胞在细胞群体中的占比和他们分泌的每种功能蛋白因子的平均荧光强度加权相乘，计算出细胞多功能强度指数（PSI）。多功能的T细胞能够在抗原的刺激下产生2种或以上的细胞因子，并被认为是重要的功能特征。

PSI=多功能细胞% × 分泌蛋白的信号强度

在扩增的第14天，T细胞在受到刺激后显示出更多的功能，特别是分泌5+细胞因子的细胞。CD4和CD8 T细胞在扩增后都表现出效应性PSI的增加。研究人员也观察到刺激性PSI的增加，特别是CD8 T细胞。与第0天的细胞相比，第14天的T细胞还分泌了更多种类的细胞因子。

PhenomeX（原IsoPlexis）的全自动、端到端解决方案进行的单细胞分析，可提供对包括CAR-T等免疫细胞产品的功能和效力的独特见解。单细胞多功能表型可以帮助优化免疫细胞产品的设计和品质控制。同时在临床试验前评估细胞功能让研究人员获得了宝贵的见解，帮助制定其早期细胞疗法的发展战略。