玩转10x Visium CytAssist，让FF样本与FFPE样本并驾“狂飙”！

在准备FF样本时，除注意将新鲜的组织迅速冷冻并正确包埋外，适当的组织处理和切片技术可以保持组织切片的形态和mRNA转录本的完整性，对于下游文库的制备和使用Visium CytAssist生成高质量的测序数据至关重要。Visium CytAssist Spatial与Visium Spatial在样本准备环节的注意事项基本相似，比如：保持切片时的恒定低温环境，在低温环境中预平衡载玻片，采用10x官方推荐试剂，实验全程使用RNase-free的水等。除此之外，用于CytAssist的样本在准备时还应注意以下几点：

对于大多数组织类型，推荐切片厚度为10µm，不过CytAssist可以兼容10−20µm的组织。对于脂肪含量较高的组织（如乳腺组织）可能需要接近20µm的切片。

应将切片贴在10x官方推荐品牌和规格的载玻片上。使用非官方推荐载玻片，可能存在组织脱片或者无法使用CytAssist正确转片的风险。

贴片时，应确保将组织贴在可以转片的区域，以确保 CytAssist转片时能够将组织转入正式玻片的样本区域中。

对于FF样本，可以送OCT包埋好的组织块，也可以送切好的冰冻组织切片。如果是包埋好的组织块，就足量干冰运输即可。如果是送冰冻组织切片，需满足以下要求：

① 每个样本需提供至少10张10μm厚度的切片或切片卷，或者相等厚度的组织块，用于RNA抽提质检；正式实验样本提供至少4张10μm厚度的目标位置连续切片；

③ 寄送样本时，将2张冰冻组织切片做好标记，背对背放入预冷的50mL离心管中，旋紧管盖，埋入足量干冰中寄送。

OCT包埋的组织块可以在密闭容器中于-80℃长期保存。OCT包埋的FF样本贴在玻片上，可以在密闭容器中于-80℃保存最长2个月。

不需要。用于FF样本测定的10x Visium CytAssist 空转流程是专门为 FF样本 OCT 包埋组织开发的，其主要目的就是将不同组织类型的透化条件进行标准化，因此不再需要专门的透化优化。根据10x官方预测，大部分类型的人和小鼠FF组织能够用于Visium CytAssist检测。已经过10x官方验证的样本类型有：人脑胶质瘤、人乳腺浸润性导管癌、人肺组织，小鼠的肺、脑、眼、肾、脾、小肠等组织。

用CytAssist做FF样本和FFPE样本，需要脱片测试吗？

匹配CytAssist转片仪的正式玻片上有2个样本区域，并有两种规格，一种捕获面积为6.5mm*6.5mm，另一种为11mm*11mm。因此，一次转片需要同时转两张玻片上的组织到2个样本区域。在框选目标区域时，可根据我们提供的样本准备指南进行目标区域框选。需要注意的是，在转片时，由于目标区域的边界是需要手动对齐的，难免会出现框选的边缘区域与正式玻片样本框的边缘区域存在细小的偏差。因此，如果您关注的目标区域中有重点关注区域，框选时请务必使重点关注区域尽量位于待转区域的中心位置，以确保转片后重点关注区域的信息能够全部被捕获到。

CytAssist FF样本和FFPE样本一样，是基于探针捕获的原理获得细胞内的基因表达信息，其技术原理与常规单细胞转录组通过3’-polyA捕获mRNA不同。10xGenomics在设计这些探针时，根据不同基因的表达丰度进行了探针覆盖度上的调整，以减少对过高表达和过低表达基因检出上的偏好性。因此，利用探针捕获的CytAssist所反映的基因表达水平上的差异与基于polyA捕获的3端转录组的基因表达差异之间不存在直接相关性。因此，如果将同一份样本的CytAssist Spatial数据与3端转录组数据进行联合分析，需考虑到这种差异。

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