重大技术革新——FFPE石蜡样本的单细胞转录组和空间转录组研究方案

2023-02-17 06:42:33, 欧易生物上海欧易生物医学科技有限公司

前言

FFPE（Formalin-fixed paraffin-embedding）即福尔马林固定石蜡包埋，全球数亿级的病理样本长期采用此方式保存。FFPE样本承载大量病理信息，是公认的宝藏资源，但由于其固定步骤导致分子交联，核酸降解严重，尤其是对样本新鲜程度要求较高的单细胞转录组测序，检测难度较大，而我们今天要讲的2个技术革新，会大大改变过往FFPE样本检测的困局。

FFPE石蜡样本单细胞解决方案：10×Genomics Flex

FLEX对FFPE样本通过脱蜡和酶消化结合的方法将其制备成悬液后，有别于过往新鲜解离单细胞转录组测序基于poly A捕获的方法，采用的是探针杂交捕获基因的方法（如图1中所示，LHS和RHS类似左右2个抓手，双双结合可增强特异性）。目前FLEX方案专用于人和小鼠样本检测，探针可覆盖的基因数分别为18000个（人）和19000个（小鼠）。

针对石蜡样本数量多的情况，FLEX支持四混一，八混一和十六混一3种混样测序方式。FLEX配套的杂交探针包含区分样本来源的Probe Barcode，每个样本与不同的探针进行杂交，就会带上特有的Probe Barcode，数据分析时可通过识别不同的Barcode将不同样本来源的Reads区分开。FLEX配套芯片有8个通道，每个通道最多可以混16个样本。

图1 探针杂交及油包水中的序列延伸示意图

探针与mRNA配对结合后，通过10×Genomics单细胞凝胶微珠的油包水分选，进行连接延伸，制备测序文库并开展测序（推荐测序数据量至少为10K reads pairs/cell），然后使用10x Genomics的Cell Ranger和Loupe Browser软件工具进行细胞类型分分析。

样本准备

FFPE石蜡样本空间转录组解决方案：10×Genomics Cytassist

空间转录组测序可以巧妙地将单细胞测序技术原理和组织切片染色结合在一起，从而研究空间分辨率下整个转录组mRNA的表达情况，同时获得同一组织切片中的组织学相关信息。对FFPE样本（DV200＞30%即可）的空间转录组检测，10× Genomics对人和小鼠的mRNA设计2段连续的特异性探针，其中一段探针的一端带有人工合作的polyA尾结构。探针被杂交后，只有靶mRNA的两段连续探针同时被杂交，探针才会进行连接。随后mRNA模板降解，探针序列从组织原位中透化，并被10×Genomics Visum芯片中5000个spot中的Oligo所捕获，随即进行延伸建库、测序分析。

图2 10×Genomics Visium FFPE空间转录组mRNA捕获流程

随着2022下半年10×Genomics Visium Cytassist 仪器的推出，过往需要组织切片贴合及脱片测试，在该仪器上30min可完成组织切片上转录组分析物的转移，并且能获得更加准确的空间信息，目前欧易已完成近50个人和小鼠FFPE样本的空间转录组检测。

图3 桌面型10×Genomics Visium Cytassist 仪器展示

样本准备

石蜡块需放置于包埋盒内，注意防撞，冰袋快递，3日内送达。

对于石蜡样本不允许带出医院的情况，提供切片即可，注意防震，冰袋快递，3日内送达，对应实验步骤所需的切片要求如下：

总结

是不是有种胜券在握的感觉？不用担心石蜡样本保存时间过长，我们可以通过检测RNA DV200 (即大于 200 个核苷酸的片段占所有片段的比值),将DV200>30%的样本进行后续实验。不要再让珍贵的样本沉睡地下，尽快结合病理信息，整理一下手头的样本库，联系我们的销售工程师，一起开动，挖掘有意义的生物学数据吧！

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