mRNA技术：站在医药浪潮之巅

2023-02-13 10:19:21, Meng Lili Merck工艺解决方案

新冠疫情的推动，使得信使 RNA (Messenger RNA, mRNA)技术一战成名，成为当下生物技术行业炙手可热的方向之一。相继获批上市的两款mRNA新冠疫苗有力证明了该项技术在预防性疫苗领域的巨大优势。和传统的疫苗制备技术相比，mRNA技术具有研发周期短、生产工艺简单、安全性高和免疫原性强等优点，是疫苗技术未来的发展方向。此外，mRNA技术作为一种通用型的平台技术，在蛋白替代疗法、癌症免疫疗法、基因编辑治疗和细胞治疗等领域都有非常广阔的应用前景。

从结构上来看，mRNA是一类单链核糖核酸，由DNA的一条链作为模板转录而来，携带遗传信息，能够指导蛋白质合成。作为生物体内基因转化成蛋白质的中间态物质，其结构早在上个世纪60年代初就已经被发现。1990年，科学家们首次证实了通过往小鼠体内注射mRNA可表达相应蛋白质并产生免疫反应，验证了mRNA作为新型药物治疗成分的设想。但是，mRNA的体内稳定性差、表达率低和免疫原性等问题，一直是制约其实际应用的技术难点。近年来，有关mRNA的结构优化、合成工艺和递送体系等关键技术不断突破，mRNA疗法取得了积极的进展。新冠疫情爆发之后，基于 mRNA技术的新冠疫苗迅速获批上市，该项技术正式登上了历史舞台。

mRNA的结构和生产优化

目前用于新冠疫苗的mRNA都是利用体外转录（In Vitro Transcription，IVT）技术合成得到（图1a）。IVT mRNA可以模拟内源性mRNA的结构，从5’端到3’端依次包含五个必要元件：5‘ 端帽（Cap）结构、5’ 端非翻译区（untranslated regions, UTR)、编码抗原蛋白的开放阅读框结构（open reading frame, ORF）、3’ UTR和Poly (A)尾（tail）(图1a)。上述每一个结构元件都可以进行优化改造，以调节IVT mRNA的稳定性、翻译能力和免疫原性。

图1. IVT mRNA的结构（a）和mRNA 疫苗的生产制备流程（b）(图片出自参考文献1)

5‘Cap包含一个通过三磷酸桥连接到mRNA 5’端的7-甲基鸟苷。5’端第一个或第二个核苷酸甲基化可以阻止细胞质传感器对病毒RNA的识别，避免出现不必要的免疫反应。此外，5’Cap还可以保护mRNA不被核酸外切酶降解，并且能与3’端的poly(A) tail、Poly(A)结合蛋白和翻译起始因子蛋白发生协同作用，诱导mRNA环化和招募核糖体启动翻译。

Poly(A) tail的长度能间接调节mRNA的翻译和半衰期，缩短和去除Poly(A)尾都会导致mRNA的降解。只有足够长度（100-150bp）的Poly(A)尾才能和Poly(A)结合蛋白进行相互作用，形成复合物，从而启动翻译。并且，一定长度的Poly(A)尾也能够保护帽结构不被脱帽酶降解。

5’和3’ UTR位于编码区两侧，能够调节mRNA的翻译效率、半衰期和亚细胞的定位。天然存在的UTR，例如α-和β-globin 基因是合成mRNA的首选。但是，不同类型的细胞中UTR的表达并不相同，因此也会根据不同的靶细胞和预期功能对序列进行相应的优化。例如，通过去除miRNA在3’ UTR的结合位点和AU富集区，可以降低mRNA的降解。另外，也可以减少5‘UTR中会形成二级和三级结构的序列区域（如发夹结构），这些区域会影响翻译起始的效率。

ORF是mRNA结构中最为重要的部分，包含编码蛋白质的序列。ORF的结构优化不如UTR部分的可选择性多，但是会通过密码子优化的方法来提高翻译效率。例如，在不改变蛋白质序列的前提下，使用常见的密码子来替换稀有密码子就是一种很好的策略。必须注意的是，对于某些蛋白质来说，稀有密码子较慢的翻译效率正是所需的。

此外，在mRNA结构中引入修饰的核苷可以提高翻译效率，如假尿苷、N1-甲基-假尿苷或者其他核苷衍生物。这是因为所有天然mRNA都包含修饰的核苷，未经修饰的单链RNA会被视为病毒感染的标志，被免疫系统通过模式识别受体（如TLR3、TLR7、TLR8和RIGI受体）识别，产生Ⅰ型干扰素，从而阻断蛋白质的合成。而使用修饰的核苷，可以帮助mRNA逃脱免疫系统的识别，表达出足够量的活性蛋白质。Pfizer/BioNTech和Moderna的mRNA新冠疫苗均采用了这个策略，在Ⅲ期临床试验中有效率超过94%。

除了优化IVT mRNA的结构，人们对其生产工艺流程也进行了优化（图1b）。例如，使用TriLink公司的CleanCap专利技术可以同步完成体外转录和Cap1型加帽两个步骤，非常高效经济。在DNA模板中增加poly(A)尾编码区，则能大大简化后续反应步骤，缩短整个生产流程和节省物料。更重要的是，该方法还可以解决使用酶促多聚腺苷酸化中得到的poly(A)尾长短不均一的问题。

mRNA递送系统

由于mRNA的分子量较大（10⁴-10⁶ Da）且带有负电荷，很难穿透由阴离子脂质双分子层构成的细胞膜。更为严重的是，mRNA在人体内很容易被自体免疫系统的细胞吞噬，或者被核酸酶降解。为了充分发挥mRNA的疗效，迫切需要一类高效、低免疫原性和低毒性的递送体系。

脂质纳米递送系统（Lipid Nanoparticle , LNP）是目前临床上最为成熟和先进的mRNA递送系统。已经上市的Pfizer/BioNTech和Moderna的mRNA新冠疫苗均采用了这类载体。LNP体系的优点在于：制备工艺简单、模块化、生物相容性好以及较大的包载量。它通常由4类脂质构成：阳离子脂质、PEG化脂质、中性脂质和辅助磷脂，不同脂质在体系中分别承担了不同的功能（图2a）。

阳离子脂质带有正电荷，可以和带有负电荷的mRNA复合，将其包载在LNP内部，是LNP体系中最为重要的一个成分。DOTMA和其合成衍生物DOTAP是最早使用的阳离子脂质，之后许多其他种类的阳离子脂质也被开发出来并使用。但是，尽管阳离子脂质能高效地包载和递送mRNA，但是它们会对人体造成一定的毒性和引发炎症反应。基于此，人们开发了第二代阳离子脂质，即离子型脂质，例如应用在上市药品Onpattro中的DLin-MC3-DMA。这类脂质的特殊之处在于，正常生理pH值条件下它们呈现电中性，相应的LNP会具有较小的毒性和较长的体内循环周期。而在内涵体等细胞器的酸性环境中，离子型脂质会被质子化，转变为带有正电荷的状态，从而更易与内涵体膜发生融合，促使mRNA得以从内涵体中逃脱，快速进入到细胞质中发挥疗效。

中性脂质通常指的是胆固醇，是一类天然脂质，在LNP中起到了提高体系稳定性的功能，同时也可以促进LNP和内涵体膜的融合。辅助磷脂的功能是调节LNP的流动性，并且也可以通过促进脂质相转变来帮助LNP与内涵体膜的融合。辅助磷脂的选择取决于阳离子脂质和所包载RNA的种类。例如，饱和性的辅助磷脂（如DSPC）是用于递送较短的RNA（如siRNA）的最佳选择，而不饱和性辅助磷脂（如DOPE）更适合递送mRNA。但是，目前已上市的两款mRNA新冠疫苗中均使用DSPC作为辅助磷脂。这样做的原因是，对于这两款疫苗中采用的阳离子/离子型脂质来说，DSPC比DOPE更有优势。并且，考虑到第一个成功上市的小核酸药物Onpattro中使用DSPC作为辅助磷脂，这也是一个更为便捷的策略。

PEG化脂质是一类脂质（如DMPE和DMG）和聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）的偶联物。PEG嵌段具有亲水性，用于稳定LNP的结构，也具有调节纳米颗粒尺寸和延长体内循环周期的功能。根据具体应用场景的需求，可以调节PEG嵌段的分子量和脂质分子的长度来改变LNP的效率、循环周期和被免疫细胞的吞噬情况。通常来说，更大的分子量和更长的链长会使纳米颗粒具有更长的体内循环周期和更少的免疫细胞吞噬。例如，Moderna和Pfizer/BNT的疫苗中使用的PEG化脂质都是分子量为2kDa的PEG嵌段和分别包含13、14个碳的脂质链嵌段。

图2. mRNA纳米递送体系：脂质纳米递送系统 (a)、聚合物纳米颗粒(b)和阳离子纳米乳液(c)（图片出自参考文献1）

除了LNP之外，基于高分子聚合物材料的polymeric nanoparticles、polyplex、lipopolyplex等聚合物纳米颗粒也因为具备和LNP相似或更为优越的mRNA递送能力而获得了高度的关注（图2b）。聚合物纳米颗粒逃脱内涵体的机理目前并不清楚，但是与LNP并不相同。有一种推测被称之为“质子海绵假说”，即聚合物的质子缓冲性能会导致内涵体渗透性膨胀直至破裂，从而实现纳米颗粒的逃逸。常用的聚合物材料有PEI和PEG多肽嵌段聚合物等。阳离子纳米乳液也可以用于递送mRNA。这种纳米乳液通常包含由角鲨烯构成的内核，外面包被有脂质层（如吐温80），mRNA被吸附在脂质外层上进行递送（图2c）。

尽管mRNA技术仍存在争议，但不可否认的是，随着新冠疫情的催化，各项关键技术的推进和mRNA疫苗的快速获批上市，属于mRNA的时代已拉开序幕，未来必定会有更多的mRNA疫苗和药物诞生。为了助力mRNA企业的研发和生产，默克公司围绕mRNA赛道，进行了深入的布局。目前默克生命科学业务部门拥有多种脂质产品，并能为客户提供定制化脂质合成服务。2021年初，默克收购了总部位于德国汉堡的全球领先的mRNA CDMO公司-AmpTec, 这一举措，使默克在原先的脂质业务板块上增加了为客户开发和生产mRNA的能力。2022年，默克持续布局mRNA赛道，以约 7.8 亿美元收购了专注研发高端注射制剂，包括脂质递送技术的Exelead公司。至此，默克能够为mRNA企业提供全过程的从临床前研发到产品商业化上市的一站式服务，显著降低供应链的复杂性并加快产品的上市速度，让更多的患者受益。

参考文献：

1. Chaudhary, N. et al. mRNA vaccines for infectious disease: principles, delivery and clinical translation. Nat. Rev. Drug. Discov. 20, 817-838 (2021)

2. Hou, X. C. et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat. Rev. Mater. 6, 1078-1094 (2021)