本刊推荐 | 扫描电子显微镜-能谱仪在吸入式干粉制剂表征中的应用进展

2023-02-13 17:14:43, 张传杰陈超等复纳科学仪器（上海）有限公司

来源：张传杰,夏星辉,郭丙如,陈超.扫描电子显微镜-能谱仪在吸入式干粉制剂表征中的应用进展[J].中国现代应用药学,2023,40(1):126-132.

张传杰 | 应用工程师

第一作者

张传杰飞纳电镜应用技术经理，兰波（苏州）智能科技有限公司应用工程师，长期从事扫描电镜操作、应用开发和培训等相关工作，熟悉各类样品的分析测试，熟悉扫描电镜在各行业的应用，参与多项扫描电镜自动化应用程序开发工作。参与国家药典委员会《扫描电子显微镜法》国家标准制订课题，并参与多个扫描电子显微镜在医药行业应用相关研究课题。以第一发明人授权发明专利2项，以第一作者发表论文3篇。

陈超 | 高级工程师

通信作者

陈超，高级工程师，从事药用辅料药包材质量分析和药包材标准研究。兼任浙江省药品接触材料质量控制研究重点实验室秘书、浙江省分析测试协会电镜微结构专业委员会理事、浙江省药品GMP检查员、浙江省药品注册研制现场核查员、长三角绿色制药协同创新中心团队成员、浙江省药学会药物分析专业委员会委员、浙江省科协服务滨江生物医药产业专家组成员、浙江省特种设备科学研究院鉴定专家。承担国家药典委员会《预灌封注射器通则》、《聚氯乙烯/聚偏二氯乙烯固体药用复合硬片标准提高》、《扫描电子显微镜法》和《聚丙烯滴眼剂瓶（三件套）》国家标准制订课题，并参与20多个药包材和辅料标准的研究课题。以第一作者发表论文20余篇，以第一发明人授权发明专利2项和实用新型专利4项。作为子课题负责人获得浙江省重点研发项目2022C01182《药包用高阻隔PVC/PVDC复合材料的研发和产业化》，作为课题负责人承担浙江省自然科学基金2023年基础公益研究计划项目LTGC23H300002《注射剂药品中微塑料/纳米塑料污染物的产生机理及检测方法研究》，作为主要参与人获得省药学会科学技术奖三等奖1项。

吸入式干粉制剂(dry powder inhaler，DPI)又称干粉吸入剂，是由原料药(active pharmaceutical ingredient，API)颗粒与载体颗粒混合而成的肺部给药递送系统。干粉吸入剂的研发过程高度依赖粉体工程技术。扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)，常简称为扫描电镜，是一种应用广泛的高分辨率成像工具，非常适合对粉体材料进行表征研究。本文就SEM-能谱仪在吸入式干粉制剂表征中的重要应用进行综述。

1 SEM

SEM是一种强大的成像工具，在分辨率、放大倍数和景深方面均优于光学显微镜。SEM的工作原理是利用电子束和样品的相互作用激发一系列电子信号，如二次电子与背散射电子。对这些信息进行收集、放大、再成像可分别得到样品的微观形貌信息(二次电子像)与成分差异信息(背散射像)。能量色散X射线谱仪(energy-dispersive X-ray spectroscopy，EDS)，常简称为能谱仪，是SEM的常见选配件，可由第三方配件公司或电镜厂商直接提供。其原理是电子束轰击样品时，可以产生含有样品成分信息的特征X射线，通过X射线探测器进行分析，就能得到样品的元素成分组成。

随着SEM与能谱分析技术日益趋于成熟，特别是近年来台式SEM的出现，SEM的操作被大大简化，而成本也得以大幅降低，使得SEM在医药行业的应用越来越广泛。SEM与EDS在各类固态药物材料的表征和检查方面有着广泛的应用，通过冷冻台，甚至可以对半固态和液态样品进行表征。

2 DPI

对于呼吸系统疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺病，通过吸入对肺部直接给药是一种常见治疗方式。作为肺部给药方式的一种，DPI在给药便捷性上具有独特的优势，易于操作，患者依从性比较高，逐渐成为治疗肺部疾病、促进大分子药物吸收的重要手段。

DPI由载体颗粒(辅料)和API颗粒组成。药物输运过程中，载体颗粒负载API进入上呼吸道，随后完成分离，API进入更深的下呼吸道，通过肺泡吸收进入血液循环。API颗粒的空气动力学直径是制剂开发的重点，直径范围1~5 μm的颗粒更容易传输至肺部深处。载体颗粒起到输运API的作用，载体颗粒的形状、尺寸分布以及表面形貌对药物递送效率有着至关重要的影响。除此之外，粉体间复杂的相互作用力是药物有效输运的关键，其中包括内聚力(API-API)和黏附力(API-载体颗粒)。过高的内聚力会导致API颗粒尺寸过大，从而无法进入肺部深处。而API与载体间的黏附力需要达到巧妙的平衡：首先作用力需要足够强，以便于API的输运；但又不能过强，API必须脱离载体，才能进入肺部深处。载体与API颗粒的作用机制以及它们可到达的不同位置见图1。

图1 人体呼吸道、颗粒大小及其沉积机制示意图

3 SEM-EDS在DPI研发中的应用

DPI的研发与制造过程涉及多种粉体技术，如API微粉化、干混、粉末填充；以及各类颗粒工程，如喷雾干燥、结晶。而显微分析是理解颗粒特征(尺寸、形貌)、颗粒相互作用的重要手段。显微分析被美国FDA列为《干粉吸入剂开发指南：化学、制造和控制》的关键技术要求：“在开发过程中，应在显微镜下检查配方和装置各组成部分”。

颗粒尺寸的常用分析工具为干法激光衍射仪，但其检测过程需要使用气流将粉体分散开，其工作条件破坏了API颗粒的内聚性，无法真实体现API的状态。在欧洲药典六部中提出，“对于激光衍射粒度分析不能区分的团聚体和分散颗粒，需要通过显微镜技术进行适当补充”。美国、欧洲及日本药典中均提出：“激光衍射程序设置前，需借助显微表征待分析样品，评估颗粒大小范围和颗粒形状”。对于DPI，API颗粒尺寸较小，往往需要用到SEM才能获得准确的表征结果。

载体粒形、表面粗糙度表征的常见方法为光学显微法，但光学显微镜分辨率较低，导致细节模糊，而SEM可提供更为清晰的细节图像。

本文从4个角度，对SEM在DPI开发相关文献中的应用案例进行了总结，并通过SEM上机实验进行方法验证。

3.1 载体颗粒形状表征

载体颗粒的形状对DPI的性能表现有着至关重要的影响。细长颗粒的空气动力学直径主要由其短轴决定。相比于球形颗粒，细长颗粒的空气动力学直径更小，药物输运性能更好，但其流动性相对较差。球形载体颗粒具有更好的流动性，但其药物输运性能往往较差。

工艺开发中，研究人员往往通过更换工艺方法、改变工艺参数，制备各类斧状、针状或不规则形状的载体颗粒，以获得最优化干粉吸入性能，而SEM是表征颗粒形状的主要工具。

Lee等使用SEM对不同工艺(喷雾干燥、研磨、筛分)制得的乳糖载体颗粒进行表征。喷雾干燥制得的颗粒往往为球形，而研磨、筛分制得颗粒形状往往为斧形。体外空气动力学实验证明，斧形颗粒具有更好的药物输送能力。

Larhrib等通过控制结晶条件，改变温度、乳糖的初始浓度、改变有机溶剂的类型或数量，制备载体颗粒。通过SEM表征不同制备条件得到的不同伸长率载体材料，证实与商用乳糖载体相比，高伸长率的载体与硫酸沙丁胺醇混合干粉具备6倍的分散性(38.5%)和细颗粒分数(29.2%)，见图2。

图2 不同工艺条件下获得的不同伸长率的载体颗粒SEM照片

为了对载体形状进行量化评价，国际标准组织定义了宽高比(aspect ratio)^[51]这一参数，计算公式如下：

其中，是颗粒的宽度，是颗粒的长度。

宽高比计算公式给出的值均介于0和1之间。越接近球形的颗粒，其宽高比越接近1；越接近针状的颗粒其宽高比越接近0。有时候也是用伸长率(elongation ratio)作为宽高比的互反定义，如公式(2)所示。

文献调研发现，多个研究团队选择通过光学显微镜采集颗粒照片，并使用配套分析软件，可实现200~500个颗粒的自动识别，并自动统计颗粒的宽高比或伸长率。而近年来，以荷兰飞纳电镜公司(Phenom-World B.V.)旗下Phenom ParticleMetric或ParticleX为代表的基于SEM的全自动颗粒粒形、粒径分析系统有了广泛的应用，可以对SEM图像中的颗粒进行自动识别，并对宽高比在内的多种粒形参数进行自动化表征，给出颗粒宽高比、圆形度等参数的柱状分布图、平均值、D10/D50/D90等统计结果。相比于光学显微镜，基于SEM的自动化分析软件具有更高分辨率，结果更准确，定量化的结果更具科学意义。

笔者使用上述自动化颗粒识别与统计系统，对2组载体颗粒进行分析实验。首先使用Phenom ProX采集2组载体颗粒的SEM图片，结果见图3A-1，3B-1。图片可见载体A为斧形，载体B更接近球形。使用Phenom ParticleMetric颗粒系统对颗粒进行自动识别，结果见图3A-2，3B-2。生成报告，给出2组载体颗粒的宽高比柱状分布图，结果见图3A-3，3B-3。并给出2组载体颗粒宽高比的平均值，D10，D50，D90等参数，见图3A-4，3B-4。统计数据表明，载体A平均宽高比0.492，接近斧形；载体B平均宽高比0.741，接近球形。宽高比统计结果与SEM图像具有直观上一致性，同时提供了精准的统计学数据，证明了这种方法的实用性与科学性。

图3 Phenom ParticleMetric载体颗粒宽高比自动分析流程及2组不同载体颗粒的实验结果

A-1–载体A颗粒扫描电镜图片；A-2–载体A颗粒识别结果；A-3–载体A颗粒软件分析宽高比柱状分布图；A-4–载体A颗粒软件分析获得的宽高比平均值、D50、D10、D90。B-1–载体B颗粒扫描电镜图片；B-2–载体B颗粒识别结果；B-3–载体B颗粒软件分析宽高比柱状分布图；B-4–载体B颗粒软件分析获得的宽高比平均值、D50、D10、D90。

3.2 载体颗粒形貌及表面粗糙度表征

载体颗粒表面形貌、表面粗糙度对API颗粒的载药量有较大影响。表面形貌越粗糙，其颗粒的比表面积越大，越利于API颗粒的吸附与驻存。SEM具有高放大倍率和高分辨率的特点而被广泛用于颗粒表面的粗糙度分析。Mönckedieck等对甘露醇载体表面粗糙度进行颗粒工程学设计，通过SEM研究了载体表面粗糙度对API颗粒吸附的影响。SEM结果显示，图4A所示载体表面光滑，载药量较低；而图4B所示载体颗粒具有更大的表面粗糙度，其凹陷处驻存的小球形API颗粒则更多。

图4 甘露醇载体颗粒形貌对于API负载量的影响

A–光滑颗粒的API负载情况；B–粗糙颗粒的API负载情况。

借助SEM表征，笔者对载体颗粒形貌对其载药能力的影响进行实验验证。结果显示载体颗粒凹陷较多，粗糙度更大，吸附在凹坑处的亮白色API颗粒较多，具有更高载药量，见图5A。载体颗粒表面凹坑较少，吸附的API较少，见图5B。

图5 乳糖载体颗粒粗糙度对于API负载量的影响

A–粗糙颗粒的API负载情况；B–光滑颗粒的API负载情况。

3.3 API颗粒附着性能分析

对于含有特征元素组分的API可以利用SEM-能谱分析技术，直接获得API在载体表面的分布情况。API颗粒含有N元素，而辅料成分为C、O元素。通过SEM-EDS进行元素面分布，其中N元素分布代表API分布，O元素分布代表载体颗粒分布。测试结果显示，API有效吸附到载体颗粒的凹坑处，结果见图6。

图6 API在载体颗粒分布情况

A-能谱面扫结果；B-微区放大电镜图。

2020年，Zhang等使用SEM-EDS对载体颗粒表面微粉化硫酸沙丁胺醇的附着情况进行研究。在图7中，辅料以O元素代表其分布，标记为黄色，其分布见图7I；API以S元素代表其分布，标记为红色，其分布见图7J；O与S分布叠加后见图7K。能谱结果显示出API成功负载于载体颗粒表面。

图7 能谱面扫表征原料药在载体颗粒表面的分布情况

H-光谱；I-氧谱；J-硫谱；K-融合图。

3.4 API颗粒分离性能评估

在干粉吸入过程中，API颗粒被载体运载至特定的位置后需要与载体完成分离，才能进入肺部深处。因此，可以利用气流模拟API-载体的分离过程，通过SEM对气流脱附前后的颗粒进行观察，判断API的分离性能。实验中，笔者首先将制剂撒到导电胶上进行SEM表征，结果见图8A，载体颗粒表面广泛分布着尺寸细小的API；使用洗耳球对样品进行吹扫，再次进行SEM表征，结果见图8B。气流吹扫后的SEM结果显示，API成分在微球表面的吸附明显减少，证明API-载体可分离性较好，可实现有利的药效释放。

图8 气流脱附前后颗粒的电镜图片

A–未经气流吹扫的原料药-载体颗粒SEM形貌；B–经气流吹扫后的原料药-载体颗粒SEM形。

4 总结

由于高分辨率、高景深、高放大倍数的特点，SEM在DPI的颗粒表征、表面形貌分析、制剂特性表征方面有着广泛的应用潜力。EDS能谱分析可在微观区域对具有特征元素的API进行标定，从而有效确认API的分布情况。

大量的结果充分验证了SEM在DPI研发中的重要作用。SEM可实现载体颗粒形状、颗粒形貌与粗糙度的有效表征。高分辨的成像使得API与载体颗粒的负载情况清晰可见。在进行粒径、粒形研究时可借助图像分析工具，将颗粒分析数量扩展到百颗甚至千颗量级，其结果更有科学统计意义。本研究表明，借助SEM-EDS可实现对API的负载情况的准确判断。

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