木糖等单糖和糖醛酸（玻尿酸）的 HPAEC-PAD 检测

摘要：单糖，自然界中最丰富的生物分子。在新陈代谢、结构组学和能量存储中起关键性作用。对碳水化合物的分析不仅对食品工业具有重要意义，而且对生命科学和材料科学研究也至关重要。本文使用AZURA®高效阴离子交换色谱-脉冲安倍检测法1（HPAEC-PAD）对生物燃料用的单糖和糖醛酸进行特定且高灵敏度的分析。

1前言

本研究使用HPAEC-PAD而不是传统HPLC方法，是因为由于糖具有极性、亲水性,且没有吸光基团，用HPLC法分析糖操作繁琐,分离时间较长,灵敏度不够高，近些年来, HPAEC-PAD的发展和不断完善为糖的分析提供了强有力的技术支持，新型的有机高聚物阴离子交换固定相在pH 0~14范围内稳定；糖类是一种pKa在12到14之间的弱酸，在pH>12的碱性条件下完全或部分电离；因此可用强碱性溶液做流动相进行阴离子交换分离。糖类化合物的还原性为直接进行安培检测提供了可能。

图1：七种单糖和两种醛酸的吡喃糖结构图

2方法及仪器

仪器

KNAUER AZURA 高效阴离子交换色谱（HPAEC）-脉冲安倍检测器（PAD，DECADE Elite电化学检测器）

实验条件

色谱条件：

流动相A

水

流动相B

200mM NaOH

流动相C

700mM NaOH

流速

0.4ml/min

系统压力

220 bar

运行温度

40℃

运行时间

35min

进样量

10 μL

进样方式

满环进样

检测器

ECD 40℃

采集频率

2Hz

时间常数

0.2sec

梯度洗脱表：

时间

min

A

(%)

B

(%)

C

(%)

流速

ml/min

0.00

100

00

0.4

11.00

100

00

0.4

11.02

98.8

1.2

0

0.4

19.98

98.8

1.2

0

0.4

20.00

30070

0.4

25.00

30070

0.4

25.50

100

00

0.4

35.00

100

00

0.4

特别提醒

1.低浓度的NaOH溶液，会使流动相中碳酸根离子结合到色谱柱上，降低分离效率。因此，每次分析前，建议使用较高浓度NaOH溶液进行色谱柱再生。

2.流动相应使用不含碳酸盐的50% NaOH溶液配制。并将配好流动相进行超声脱气，（现配现用）。

3.由于DECADE Elite电化学检测器的高灵敏度和NaOH的腐蚀性，减少干扰离子、硅酸盐或硼酸盐的检出，本实验只能使用塑料溶剂瓶等塑料制品。

采用四电位波形进行检测（详见图2）

图2：四步PAD电位波形，检测单糖等碳水化合物。红色为样品检测阶段。

3结果

0.1 mg/mL九种目标物混标，分离度R>1.5，九种目标物均可分离（图3）。当木糖（6）和甘露糖（7）在浓度＞0.1 mg/mL时不能分开。且随着浓度增加，样品不能进行分离。

分区域进行噪声计算，对于单糖（前7个化合物峰），采用0.001μA为平均噪声，对于糖醛酸（后2个化合物峰），采用0.1μA为平均噪声，根据数据计算得出每个分析物的信噪比（S/N）见表1。

每种化合物0.0125至0.25 mg/mL范围内的浓度曲线如图4所示。

图3：0.1mg/ml九种混标物色谱图

图4：0.0125 mg/mL至0.25 mg/mL范围内单糖和糖醛酸的浓度曲线

表1：七种单糖和两种糖醛酸信噪比表

分析物

信噪比（S/N）

L-岩藻糖

10000

L-鼠李糖

3000

L-阿拉伯糖

4800

D-半乳糖

3800

D-葡萄糖

2400

D-木糖

1600

D-甘露糖

1600

D-半乳糖醛酸

338

D-葡萄糖醛酸

574

4结论

AZURA  HPAEC-PAD是一种分析单糖和其他碳水化合物的高灵敏度仪器。七种单糖和两种糖醛酸的混合物可以高效分离。色谱条件简单，即使在低浓度下也能实现快速且可重复的分析。除了对生物燃料的研究外，也可对糖在自然界和食品中成分组成以及变化进行分析研究。

5配置表

模块描述货号泵

AZURA P6.1L 四元10ml低压生物惰性液相泵

APH39EA

自动进样器

AS6.1L生物惰性自动进样器

AAA20AA

检测器

DECADE Elite电化学检测器

带 Au HyREF  SenCell

A07545

A07546-3

柱子

Dionex™   CarboPac™PA20 250x4mm

B08154-1

预柱

CarboPac™PA20 30x3mm

B081517

软件

Clarity

A1670

1.安培检测是通过测量电化学活性物质在适当施加电位下在工作电极表面发生氧化或还原反应时所产生的电流变化,而对物质进行分析测定的一种检测技术,其主要优点是灵敏度高、选择性好、响应范围宽及仪器结构简单。安培检测器的检测池包含工作电极、参比电极和对电极3种电极。电化学反应发生在工作电极上,但反应的前提是需要在工作电极与参比电极之间施加一个适当的电位(电压)。根据施加电位方式的不同,安培检测法可分为恒电位安培检测法和脉冲安培检测法。

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