Primer Express® Software——让探针引物设计变成小菜一碟

2023-02-06 10:40:24, FAS 邱川赛默飞世尔科技生命科学产品

导师

小明，来，这个实验中需要qPCR检测一下A、B、C基因的表达变化，先赶紧设计一下探针和引物。

师姐

小明，基因A的表达变化qPCR检测结果中熔解曲线显示有非特异性熔解峰，重新设计几对引物吧。

……

小明

作为生物圈科研狗的我们，是不是经常会遇到此类问题呢？如果你恰好是一名刚刚入圈的科研小白，面对突如其来的安排可能会不知所措：引物？探针？怎么设计呀？该怎么办？必定有些焦头烂额。如果你是一位已经久经沙场的科研斗士，或许能从容面对，但也许为了寻思着该如何将其设计得更好，也会稍费一番周折。不用担心，今天在此，我们就为各位客官介绍赛默飞旗下Applied Biosystems^TM品牌一款简单易用的探针引物设计软件 Primer Express^® Software的用法。无论您是一名新晋的科研小白还是一名科研达人，相信它定会让您的探针引物设计工作从此变得小菜一碟。

在正式介绍之前，首先，我们有必要在设计探针和引物前对所选的序列质量进行评估，其质量的好坏在某种程度上决定了后续设计的成败和质量，主要从以下几个方面考量：

● 生物学意义：

选择可以获得生物学意义的序列，以确保使用该序列设计的引物和探针在实验中产生有用的信息。例如：包含突变位点、SNP位点等。

● 序列独特性：

确认目标序列在你所研究的生物体中是独一无二的。例如：对序列进行BLAT®或BLAST®数据库检索、利用Entrez基因数据库查找外显子信息、屏蔽序列重复等。

● 序列质量：

使用已经确认是准确的序列，例如参考公共数据库来验证准确性。

● 避免不必要的设计区域：

将不想设计为引物和探针的区域从序列区域中消除掉，例如：屏蔽非目标多态性的序列。

其次，我们还需总体了解一下探针和引物的设计原则。一般而言，探针的设计原则如下：

● 优先考虑探针位置

● 探针的5''端第一个碱基不能是G

● 基因表达探针Tm值：68-70℃；基因分型探针Tm值：65-67℃

● TaqMan探针长度13-30bp，TaqMan-MGB探针长度在13-25bp

● 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G

● C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链

● 多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基

● 基因表达探针，跨过两个外显子进行探针设计，以增强扩增特异性

引物设计原则：

● 引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠

● 引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间

● 避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G

● 引物Tm值在58-60℃之间，上下游引物Tm差异不要超过2℃

● 引物3’端的5个碱基中，G和C加起来不要超过2个

● 引物3’端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基

● 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对

● 避免引物自身形成环状发卡结构

● 扩增片段的长度在50-150bp之间

只有充分掌握了上述这些基本原则，万变不离其宗，这样我们设计起来才会得心应手。下面，我们就介绍一下如何使用Primer Express^®Software进行基因表达探针和引物的设计方法。

Primer Express^®Software设计时包含自动设计和手动设计两种方式，对此将逐一展开介绍。

一

自动设计

1. 双击电脑桌面上的Primer Express 3.0.x软件图标，打开软件，点击Continue with Primer Express进入软件主界面。

2. 点击图标或Flie → New ，在弹出的对话框中选择 “TaqMan MGB Quantification 或 TaqMan Quantification”→ OK

3. 在弹出对话框的“Sequence” Tab中，直接将待设计靶基因的mRNA序列复制粘贴到空白处。

或在Tools →选择 “Add DNA File” ，找到已存储的靶基因mRNA序列文件（.txt, .ab1, .FASTA文件格式），点击“Add”，将序列加入空白文件。

4. 点击

图标或Tools → Find Primers/Probes，软件即开始使用默认的参数自动设计合适的Primers/Probe pairs。

Primer Express软件会找到Candidate Primers & Probes，一次search最多能找到50种组合，这些组合展示于“Primers / Probes” Tab中，请注意若是进行SYBR Green primer设计，不需看probe序列，只需参考primer序列组合。中间“Location”栏显示primers & probes在序列中的相对位置，在横线上方的数字代表起始位置，横线下方则代表终止位置。

5. 查看设计结果。在“Primers / Probes” Tab中会将每对Primers/Probes的组合列出来，一般来讲，挑选Penalty数值和Amplicon length数值越低的Primers/Probes组合越好。点击“Sequence” Tab，会显示出与“Primers / Probes” Tab相对应的一对Primers/Probe：粉红色片段是Probe的位置，蓝色代表Forward Primer，黄色片段则为Reverse Primer，如下图所示。

6. 如果是SYBR Green primer设计，必须要注意避免有primer dimer的产生：在“Primers / Probes” Tab中任选一组primer set，在“Secondary Structure”栏中，查看右下方的Hairpin、Self Dimers及Cross Dimers的情况，选择键结合数越少的组合越好，其中又以GC的键结合比例越少越好（如下图红方框所示）。

7. 将所选择的Candidate Primers & Probes挑选好后，可点击Order → Export的方式，将设计好的探针和引物序列保存成.txt文档导出。

8. 默认参数设计为最优，但也最严格。在使用默认参数自动设计失败的情况下，可以适当调整放宽参数设置。此时，可以自行在“Parameters” tab中修改参数后再重复上述4-7步骤完成探针和引物设计。

二

手动设计

当软件无法自动找到Primer/Probe组合或出现下列情形时：

● 需要跨外显子设计探针

● 为DNA序列同源物设计探针

● 需要根据自己的技术参数设计引物和探针

此时，就需要先确定Primer/Probe想要放置的位置，然后进行手动设计。

1. 探针Probe的设计

在“Sequence” Tab中将想使用的Probe序列标亮起来 (至少25 bp长度，长度依序列结构而定)后，先利用Edit中Copy (Ctrl+C) 功能复制序列，再点击Tools→ Primer Probe Test Tool，选择欲设计的document type (即“TaqMan MGB Quantification或TaqMan Quantification”)，并确认Parameter设定为“Default”，再利用Paste (Ctrl+V) 将序列粘贴在Probe 1栏中，从右边即可观察测试序列的Tm、 %GC和长度是否合适。注意: probe第一个碱基不能为G，且序列里面C的数目要比G多。

若此时Tm超过设定值(68℃ to 70℃)，可直接在Probe 1框中选不同的序列片段，并观察右边对应的Tm、%GC和长度，以找出最合适的Probe (需参照primer/ probe 设计原则)，若框选到适合的序列，点一下“Trim”，就可以将未框选的序列直接删除，而留下需要的Probe序列。

当Probe序列确定之后，回到“Sequence” Tab中将Probe序列highlight起来并利用Edit → Annotate → “Probe” 将probe序列固定起来，此时probe的位置会被标定成绿色。

然后，可利用Tools → Find Primers/ Probes，找出与设定的Probe配对的Forward / Reverse Primers。若自动搜索无法找到配对的Primers可依以下步骤进行Forward / Reverse Primers的设计。

2. Forward/Reverse Primer设计

在“Sequence” Tab中将想使用的Forward Primer序列标亮起来 (至少25 bp长度，切勿与probe序列重叠)后，先利用Edit中Copy (Ctrl+C) 功能复制序列，再点击Tools→ Primer Probe Test Tool，再利用Paste (Ctrl+V) 将序列粘贴在Fwd Primer栏中，从右边即可观察测试序列的Tm、 %GC和长度是否合适。

确认Forward Primer的Tm值在58-60℃，如果Tm值不符合，可直接在Fwd Primer框中选不同的序列片段，并观察右边对应的Tm、%GC和长度，以找出最合适的Primer (需参照primer/ probe 设计原则)，若框选到适合的序列，点一下“Trim”，就可以将未框选的序列直接删除，而留下需要的Primer序列。

当Fwd Primer序列确定之后，回到“Sequence” Tab中将Fwd Primer序列highlight起来并利用Edit → Annotate → “Fwd Primer” 将Fwd Primer序列固定起来，此时Fwd Primer的位置会被标定成蓝色。

Reverse Primer设计方法同上述Forward Primer，当Rev Primer序列确认并被固定下来后Rev Primer的位置会被标定成粉色。

若是进行SYBR Green primer设计，必须要注意避免有primer dimer的产生，此时可以点击“Show Secondary Stucture”，即可从右下方来查看此组Primers的二级结构，如Hairpin, Self Dimers及Cross Dimers的情况。如果此组primer二级结构严重，需重新寻找适当位点。

3. Primer/Probe序列存储

选定primer/ probe 后可用Copy & Paste功能把对应序列保存到一个新的text文档中，并save保存起来。另外，也可以把此次设计document进行存档，点击File → Save As保存。

以上就是同大家介绍的如何使用PrimerExpress^®Software进行基因表达探针和引物的设计方法，是不是很简单呢？各位小伙伴们，赶紧来试一试吧！

此外，如果各位小伙伴担心自行设计的探针和引物可能存在不好用的风险的话，赛默飞为各位提供数以万计优化好的TaqMan Assay。TaqMan Assay中包含了您实验所需要的引物和 TaqMan探针，引物探针的浓度和反应条件都已经优化好，开盖即用，非常方便哦。具体请参考《如何为荧光定量PCR选择合适的TaqMan Assay？》一文。

参考文献：

1. Getting Started Guide: Primer Express® Software Version 3.0

2. Application Notes & Tutorials: Designing TaqMan® MGB Probe and Primer Sets for Gene Expression Using Primer Express^® Software Version 2.0: Guide: Rev A

3. Custom TaqMan® Assays DESIGN AND ORDERING GUIDE：For SNP Genotyping and Gene Expression Assays：Rev G