Absolute Q数字PCR在禽血成分定量中的应用

图1 BJS 202309《鸭血中鸭鸡鹅源性成分的测定》

本文介绍了一种采用Absolute Q^TM 数字PCR平台进行鸭血中鸡鸭鹅源性成分测定的应用方案，其具有以下特点：

• 操作简单，检测周期短；

• 有效反应数高，检测死体积小，结果稳定；

• 通量灵活，应用拓展性强；

其流程如下（图2）：

图2 禽血成分Absolute Q数字PCR定量检测方案流程

参照BJS 202309《鸭血中鸭鸡鹅源性成分的测定》标准进行制备，完成DNA提取后定量并稀释至10 ng/μL。

参照BJS 202309《鸭血中鸭鸡鹅源性成分的测定》标准进行制备。本文根据标准要求，按不同比例混合鸭血粉和鸡（或鹅）血粉，制备一系列标准曲线用样品，使鸭血占总质量的百分比分别为 0.5%、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、99.5%，并对上述混合样品进行核酸提取，提取后定量并稀释至10 ng/μL。

合成相应探针引物并按下表配置10X Assay

按照下表配置反应体系并根据Absolute Q操作手册进行上样及PCR扩增。每个浓度梯度及未知样品均设置3重复，阴性样品使用无酶水；

依据BJS 202309标准，根据标准品的检测结果，以鸡（或鹅）质量占总质量的百分比为横坐标，鸡（或鹅）基因拷贝数占总基因拷贝数百分比为纵坐标绘制线性标准曲线，再代入未知样品的拷贝数比例，计算鸭血实际含量。

“鸡血混鸭血”与“鹅血混鸭血”两组实验结果均达到要求，以下展示鹅血混鸭血实验结果：

本次实验中，所有样品有效反应数均 > 20000，有效检测反应数超 95%（标准中要求“有效微滴≥仪器理论数 60%”），阴性对照无阳性扩增，阴阳性微孔分簇清晰（图3）

9个梯度标准曲线的 R²=0.9996（标准中要求选取5 个适宜的点，R²≥0.99）（图4）；

对未知鹅鸭血混合样品进行了三重复检测（如下表所示），并计算鸭血拷贝数比例，结果显示三次重复CV%值为0.96%。

根据标准曲线拟合公式Y=0.9875X，最终计算出未知样品的鸭血比例为46.19%。

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