聊聊RNA质控

聊聊RNA质控

众所周知，在中心法则中，RNA 是 DNA 到蛋白表达之间的转录媒介。比起检测DNA, 检测RNA更能客观反映出生物体内的基因表达情况。涉及到RNA 的实验包括：qRT-PCR、RNA-Seq、以及融合基因检测等。基于RNA 本身的特性 （RNA的糖环上比DNA的糖环多一个自由羟基），加上环境中大量的RNA 酶，RNA 比起 DNA 更不稳定，也更容易被降解。Garbage in, garbage out，如果RNA的质量欠佳，那么实验结果也必然是不理想的，具体表现为数据的不准确或者是重复性不好。所以，对于RNA 的处理需要更加留心，质控的环节也更加重要，以确保后续实验数据的精密度和准确度。

对于RNA 的质控，一般有以下几种常用的方法：

分光光度法

琼脂糖凝胶电泳法

Agilent生物分析仪

实时荧光定量PCR法

Qubit 荧光染料法

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分光光度法

RNA 具有共轭双键，在 260nm 的波长处有吸收峰。根据朗伯比尔定律，我们可通过260nm的吸收峰计算RNA浓度。除此之外，我们也可以根据260nm 和 280nm 及 230nm吸收峰的比值来计算 RNA 的纯度。280nm 和 230nm 分别是蛋白质和小分子的吸收峰。合格的RNA 纯度的A260/A280以及 A260/A230 的比值应该大于2。如果小于2，则表示RNA 样本中存有蛋白质或者小分子污染，需要再次纯化。污染源会影响下游的实验，譬如会抑制PCR反应的扩增效率，导致定量结果的不准确。RNA 纯度对后续结果影响重大，所以分光光度法一般是核酸实验中第一步不可或缺的质控环节。

图一，典型的 RNA/DNA 吸收光谱

琼脂糖凝胶电泳法

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除了纯度，RNA 的完整度也是判断RNA 质量的重要指标之一。RNA 的降解会导致样本中出现大量的短片段，那么能被有效检测出并覆盖到参比序列的RNA 片段就会减少。RNA 的完整度可以通过对总RNA 进行1% 的琼脂糖凝胶电泳来查看。此方法可以自己配置凝胶，也可以使用预制好的E-Gel™ System进行完整度检测。总RNA 中的80%以上是核糖体RNA，其中大多数是由28S和18S rRNA组成的（在哺乳动物系统中）。质量好的RNA 会呈现两条明显的亮条，分别是 28S 和 18S 的亮条，位置在 5 Kb 和 2 Kb，比值会倾向接近于 2:1。如果是呈弥散状态，那么就表示RNA 样本可能已经降解，建议使用后续介绍的方法进一步检测RNA 的质量。

图二，降解 (lane 2) 及完整的RNA (lane 3) 在琼脂糖凝胶电泳图上的比较

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Agilent生物分析仪

除了以上介绍的琼脂糖凝胶电泳法可以简单快速地来帮助我们鉴定RNA 的完整度，我们还可以通过Agilent 生物分析仪来判定RNA的完整度。它结合使用微流体、毛细管电泳和荧光来评估RNA浓度及完整性。通过使用内置的算法分析RNA 样本的峰图，Agilent 生物分析仪可计算出一个可作参考的RNA 完整值，RNA Integrity Number (以下简称RIN) 【1】。RIN 的数值越大表示RNA完整度越高（1为降解极度严重，10为最完整）。一些涉及到RNA的实验会建议使用RIN 作为质量评估的参数。以高通量测序实验（以下简称NGS）为例，赛默飞Oncomine panel系列中用来检测 B 细胞和 T 细胞抗原受体的  Oncomine™ Human Immune Repertoire的指南中就提示 RIN 值大于4的样本，能测出更多的有效 reads 及克隆数 (图三)。对于不同的panel 会有不同推荐使用的范围，往往越高的RIN 能带来更多的有效数据。

图三，在Oncomine™ Human Immune Repertoire 的实验中，RIN大于4的样本，能测出更多的有效 reads 及T细胞克隆数。【2】

不过，RIN值也有一些局限性，RIN 虽然和NGS实验数据质量有很高的相关性，它并不适用于FFPE样本。FFPE 样本经过了长时间的化学处理，提取出来的RNA 一般 RIN 值都比较低。不过，这不意味着实验的有效数据一定是不理想的。要准确评估FFPE 样本的质量，我们需要使用除了RIN以外的测量方法。Agilent 生物分析仪除了RIN 之外，也能计算出 DV200值作为RNA 质量的评估参数。DV200 是一种计算大于200 bp 片段在RNA样本中占比的参数。相较于RIN，DV200 能更好地提示FFPE 样本的质量。对于FFPE提取出来的RNA，它和能有效被检测的基因数及基因的多元性有极高的相关性【3】。虽然DV200能弥补关于FFPE质量检测中的不足，但是Agilent生物分析仪仍然无法全面分析RNA 样品中的质量问题，其中就包括样品中是否存在着抑制剂。抑制剂本身会影响下游实验的扩增效率并降低有效数据量。要得知样品中是否存在抑制剂，我们可以采取接下来介绍的实时荧光定量PCR法。

实时荧光定量PCR法

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实时荧光定量PCR法不仅能检测样品中的抑制剂，也能准确反映FFPE样本中RNA的质量。相较于Agilent 生物分析仪, 由于应用层面更广，实时荧光定量仪在各大生物实验室更加普及。要检测RNA 样本的质量，我们只需要购买或制定内参基因的引物探针，譬如 GUSB (Cat no. Hs00939627)。通过利用这套引物探针和标准品(已知浓度的总RNA) 进行绝对定量的实验，就能计算出有效RNA 片段浓度作为RNA质量的评估标准（Functional RNA Quantitation 简称FRQ） 。在一次NGS的测试中，我们发现 RNA 样本的FRQ 和有效数据量有极高的相关性。所有大于0.2ng/uL FRQ的样本, 有至少70% 的reads  能有效覆盖到参比序列 （图四）。

图四，通过荧光定量方法检测出的FRQ值与NGS实验中得出的有效数据数据呈极高的相关性（R2>0.9）。红线为FRQ 值等于0.2 ng/uL （log10 = -0.7）。【4】

除了适用于FFPE 样本之外，荧光定量PCR的方法还能有效监测样本中的抑制剂。我们可以在带有Internal Positive Control (IPC)及其 Assay 的反应体系中加入要检测的样本，接着进行荧光定量得出Ct 值。如果Ct值比无样本反应中的Ct 值还要滞后，那就表示样品中存在抑制剂并抑制了反应中的扩增效率。

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Qubit 荧光染料法

Qubit 荧光计作为操作简便、最常用的核酸浓度和纯度检测小设备，几乎存在于每一个分子生物学实验室里。它通过检测和核酸结合的荧光染料（Qubit 检测试剂）来准确计算核酸的浓度。Qubit 的灵敏度及特异性较高，可以精确定量RNA 低至 pg/µL 的浓度。除了大家熟悉的能精确定量核酸浓度之外，赛默飞最新推出的新型号 Qubit 4. 0还能够检测RNA的完整度。Qubit 4.0 的 RNA检测系统 (RNA IQ Assay) 通过同时检测两种特异荧光染料来检测RNA的完整度。这两种荧光染料分别能够和大片段及小片段RNA 进行结合。这两种荧光染料提示了大片段RNA 在样品中的占比，并由此可以计算出代表RNA质量的 IQ (Integrity and Quality) 值。IQ 值同时适用于 FFPE 和 非 FFPE 样本，对后续的测序质量也有着较大的影响。以NGS实验来说，在Ion torrent™ 平台上进行的RNA-Seq 测试实验中，大部分IQ 值大于4的样本中至少有 50% 以上的有效reads （图五）。相较于上述的检测方法，Qubit IQ Assay 不仅操作更方便，时间短（五分钟内），而且测量参数IQ 值也与下游实验的数据质量有极大的相关性。

图五， Qubit RNA IQ 值和 RNA-Seq 的 mapped reads 有极大的相关性。【5】

通过以上介绍，相信大家已经对不同的RNA质控方法有了足够的了解，在实践中可以针对样本类型及现有的仪器来进行相应的方法选择。唯有很好的把控RNA 的质量，我们才能避免因样品质量不好导致的后续实验失败，从而可以节省宝贵的时间、精力和成本。

参考文献

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biol 7, 3 (2006). https://doi.org/10.1186/1471-2199-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Enhanced Quality Metrics for Assessing RNA Derived From Archival Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue Samples, Toxicological Sciences, Volume 170, Issue 2, August 2019, Pages 357–373, https://doi.org/10.1093/toxsci/kfz113

【4】Methodology for assessing quality of RNA from FFPE samples for the Oncomine Immune Response Research Assay. Ion Torrent. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/ffpe-rna-quality-oirra- app-note.pdf

【5】 Qubit RNA IQ Assay: a fast and easy fluorometric RNA quality assessment. Thermo Fisher Scientific. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Application-Notes/qubit-rna-iq-assay-fluorometric-rna-quality-assessment-app-note.pdf