免疫荧光信号弱？这些技巧必知！

接下来，我们来看看看免疫荧光都有哪些步骤：

根据靶点的表达情况，免疫荧光有多种信号放大实验方案可以选择。如果目标分子不是高表达的，信号放大方案选择不当就很可能导致免疫荧光信号弱，甚至没有信号的问题。

如果靶点是中低丰度的蛋白质，普通的荧光基团偶联的二抗标记可能不能得到优异的信号，则需要信号放大程度更高的方法，或亮度更高的荧光基团偶联二抗进行信号提升。

如果靶点是低丰度的蛋白质，可能需要信号放大倍数更高的方法，比如酪胺信号放大技术，来进一步增强信号，从而轻松检测到低丰度、难以检测到的蛋白。

划重点——免疫荧光实验方案选择

• 中高丰度的靶蛋白：使用Invitrogen Alexa Fluor偶联二抗对信号进行适度放大

• 中低丰度的靶蛋白：使用Alexa Fluor 链霉亲和素偶联物或Alexa Fluor Plus二抗实现信号提升

• 低丰度靶蛋白：使用酪胺SuperBoost试剂盒实现信号最大化

由于免疫荧光实验的核心原理是待检测靶点的抗体对靶点的特异性识别，抗体的选择是免疫荧光实验至关重要的步骤，使用正确且有效的抗体是特异性、灵敏的靶点检测的前提，也是拍到高分辨率、清晰的图像的先决条件。

免疫荧光实验信号弱可能由哪些的抗体相关的问题引起的呢？我们要怎么解决或规避这些问题呢？

在为任何基于抗体的检测实验选择抗体时，不仅仅要考虑特定抗体是不是针对待测靶点的，还要考虑到该抗体是不是可以用于目标的检测方法，以及抗体的方法适用性是不是经过验证的、有没有相应的数据支持。

划重点——免疫荧光抗体选择

• 选择经过免疫荧光验证的一抗

• 二抗选择时谨记一抗的种属和亚型

• 正确储存抗体、使用效期内的抗体

免疫荧光实验涉及的各个步骤都会使用到相应的试剂，这些试剂的过期、失效或选择不当可能导致免疫荧光实验信号弱或无信号，比如固定液4% 多聚甲醛需现配现用，如放置太久会发生醛基氧化、影响染色效果。

为了应对免疫荧光实验自制试剂的不稳定性、减少繁琐的试剂配置工作、简化工作流程，Invitrogen推出一系列的针对抗体染色和成像的专用试剂：

划重点——免疫荧光试剂选择

• 紧密关注试剂的效期和储存条件

• 选择成品试剂，优化流程、保证实验结果稳定性

  
  

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