想要拍出高质量的多色免疫荧光图，这些个秘诀或许能帮到你！

造成荧光信号弱的原因很多。比如样本本身的原因：样本是否保存恰当、靶标蛋白丰度如何等都需要考虑；比如操作问题，可能追溯的原因也很多：固定方法是否破坏抗原表位、拍照操作是否正确、抗体使用是否合适等都有可能。另外，值得一提的是，作为放大效应的「执行者」，高亮度的荧光二抗是提升信号的关键。

对于一些高丰度靶标比如 β-tubulin 等，可采用直标一抗（直接法）提供明亮且特异性强的信号，操作简单，且更容易实现同宿主一抗的多色分析，非特异性背景低，不过灵敏度相对也较低。对于中丰度的靶标， 一般选用标记二抗放大信号，可提高灵敏度（如图 1 所示）。

Alexa Fluor 荧光二抗的荧光信号强度高于其他传统荧光标记，被广泛使用和认同。对于珍贵样本的低丰度靶标检测，推荐选用创新型Alexa Fluor Plus 荧光二抗，能提供更高信噪比从而获取更多结果。

图1. Alexa Fluor Plus 405（左图，羊抗兔 IgG 二抗，A48254）与 Dy Light 405（右图）分别检测细胞中的 β-III  微管蛋白。Alexa Fluor Plus 405 信号更优。

苍天啊心疼我的样本，信号一开始好好的，但拍着拍着就没了，荧光淬灭太严重。一朝又回到解放前……如何应对？

出现这样的问题，除了在操作上要尽量注意避光和使用抗淬灭剂的一些建议外，荧光染料的选择也很重要。例如一些荧光蛋白如 GFP、RFP 很容易发生光漂白，从而导致灵敏度大大降低，常见于靶标分子丰度较低、激发光较强或激发持续时间长等情况。

Alexa Fluor 荧光二抗就能很好改善这个问题，它比绝大多数荧光复合物更耐光淬灭，可提高灵敏度，让您可以从样本中获得更多的信号。不仅如此，其对 pH 值变化极不敏感，在 pH 值 2.5~10 变化的环境中仍保持极高稳定性。

导致免疫荧光高背景的原因不胜其数，比如：封闭和洗涤是否正确？抗体浓度太高？自发荧光干扰？

事实上从二抗自身角度出发，也能发掘出很多原因。比如：是否选用了预吸附二抗？特别是在多色荧光分析中，往往需要多个一抗搭配二抗实验，这就要求使用在非一抗种属中制备的预吸附二抗，降低二抗交叉风险，从而减少背景产生。再者，对于 IgG 丰富的样本，选用预吸附二抗也能起到减少背景的作用。

光谱重叠也可能是背景来源之一，特别是对于多色荧光分析，这对荧光基团光谱范围和数量提出了更高的要求。

Invitrogen 提供了的丰富的高度交叉吸附 Alexa fluor 系列荧光二抗，有较小的光谱重叠，同时光谱覆盖了405-800nm，为多色荧光检测提供更多选择。值得一提的是，其中， Alexa Fluor Plus 能提供更高的信噪比，因此更适合有挑战性的样本，譬如神经相关的样本（如图 2 所示）。

图2. 免疫荧光分析 Alexa Fluor 647 （左）与  Alexa Fluor Plus 647 （右，羊抗小鼠  IgG  二抗，货号 A32728，粉色）检测  E18 Sprague Dawley  原代皮层神经元细胞中的  β-III  微管蛋白。Alexa Fluor Plus 647 （右图）可让您观察更多细节。

Alexa Fluor 系列荧光二抗和传统染料二抗的技术比较，见表 1。

表1 Alexa Fluor 系列荧光二抗和传统染料二抗的技术比较

部分 Alexa Fluor Plus 荧光二抗产品，见表 2。

表2 部分 Alexa Fluor Plus 荧光二抗产品

目前 Invitrogen的Alexa Fluor 系列荧光二抗家族还在不断壮大中，专门解决很多诸如弱信号、高背景、光淬灭等问题，且可选物种和荧光基团种类齐全，加速您的实验研究。