项目文章 | 单细胞测序揭示来源于激活血管平滑肌的细胞外捕捉驱动动脉粥样硬化的进展

期刊：Nature Communications

影响因子：17.694

发表年月：2022-12-06

材料：分别取自B6-G/R Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠和B6-G/R Myh11^Cre小鼠(每组6只)的主动脉

方法：10x Genomics单细胞3端测序

细胞外捕捉现象(ETs)是一种先天免疫反应，细胞将DNA释放到细胞外空间，形成由解聚染色质、瓜氨酸化组蛋白和细胞蛋白组成的网状结构。ETs的形成最早是由Brinkmann等人在中性粒细胞中发现的，被认为是一种消灭微生物的有效防御反应。

近年来发现细胞外捕捉在非传染性和无菌性疾病中也有重要作用，如系统性红斑狼疮、血管炎等，并且除中性粒细胞外，巨噬细胞等免疫细胞也可以产生细胞外捕捉。但目前对于细胞外捕捉在动脉粥样硬化中的研究显示其影响了动脉粥样硬化，但动脉粥硬化并非依赖中性粒细胞来源的途径，因此探索是否存在其他细胞来源的细胞外捕捉途径对动脉粥硬化的进展研究有相当意义。

Result1 巨噬细胞是晚期斑块中细胞外捕捉的重要来源

为了追踪ETs+ CD68+ VSMCs的起源，作者建立了VSMCs谱系追踪小鼠模型B6-G/R Myh11Cre，发现斑块内的Tdtomato+ VSMCs比正常主动脉内侧层的Tdtomato+ VSMCs表达更高水平的PAD4 ，说明VSMCs在动脉粥样硬化条件下可能产生ETs。

油红O染色和CCK8结果显示72 h时阳性细胞比例最高，存活率最高(图2a-c)。与对照组相比，胆固醇负载的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(RASMCs)巨噬细胞标志物的mRNA表达水平更高，VSMCs收缩标志物表达水平降低(图2d)，WB也证实了α-SMA和CD68蛋白水平的变化(图2e-g)。同时，与对照组相比，装载胆固醇的RASMCs具有更多的吞噬生物颗粒和更高的吞噬基因表达。

随后作者分别比较了PDGF诱导的RASMCs、转分化RASMCs和去分化RASMCs中PADs家族mRNA的表达水平，发现PAD家族成员中PAD4大多升高。通过WB和IF(图2k)，发现胆固醇负载后，PAD4在RASMCs中的表达大幅上调。氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)被广泛研究为动脉粥样硬化发展的危险因素，作者发现ox-LDL可以诱导CD68+ VSMCs体外生成ETs。

为了进一步明确血管平滑肌细胞来源巨噬细胞外捕捉对斑块进展的影响，作者构建了三基因敲除小鼠(Myh11^Cre/B6G/Pad4^flox/flox)并制成动脉粥样硬化模型，发现VSMCs中仅缺失PAD4导致病变尺寸在24周时显著减小了(图3b-f)，Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠血浆dsDNA浓度也降低了(图3g)，α-SMA、CD68和H3CIT的IF染色显示，VSMCs中PAD4的抑制抑制了Myh11^CrePad4^flox/flox中CD68+VSMCs释放的ETs，而不改变头臂动脉（BCA）损伤或主动脉根部损伤中髓系巨噬细胞产生的ETs（图3h–l ）。α-SMA、CD68和H3CIT的IF染色显示，VSMCs中PAD4的抑制抑制了Myh11^CrePad4^flox/flox中CD68+VSMCs释放的ETs（P＜0.01），而不改变头臂动脉（BCA）损伤或主动脉根部损伤中髓系巨噬细胞产生的ETs（图3h–l ）。这种变化确实降低了CD68+细胞总数中CD68+VSMCs的比例。

与对照组小鼠相比，作者观察到坏死面积减少（图3m，n），纤维面积增加（图3o，p），CD68+面积减少（见图3q，r），Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠的BCA损伤或主动脉根部损伤中MMP9+面积减少（图3s、t）。此外，作者还发现，在来自人吸入性动脉粥样硬化斑块的三个样本中，ETs由CD68+VSMCs产生，ETs阳性CD68+VSMCs的区域与一系列相邻切片中的MMP9阳性区域相关。这些发现强调了CD68+VSMCs对于晚期斑块中ETs的产生至关重要，这在加速斑块的不稳定性和动脉粥样硬化进展中发挥了关键作用。

 Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠中CD68+ VSMCs的比例低于Pad4^flox/flox小鼠，作者推测，巨噬细胞总数的降低可能与ETs减少导致CD68+ VSMCs减少有关。因此，作者以B6-G/R Myh11^Cre小鼠作为对照，生成VSMCs谱系追踪小鼠B6-G/R Myh11^CrePad4^flox/flox (图4a)。在B6-G/R Myh11CrePad4flox/flox小鼠中，抑制斑块大小和脂质含量也得到了类似的结果(图4b, c)。此外，与对照组相比，B6-G/R Myh11CrePad4flox/flox组血浆中dsDNA浓度也较低(图4d)。由此可见，ETs是由CD68+ VSMCs释放的，而非去分化的VSMCs释放的，并且ETs在VSMCs向CD68+ VSMCs转分化中起着至关重要的作用，从而影响斑块负担和稳定性。

Result6 ScRNA-seq结合vsmcs谱系追踪技术揭示了抑制ETs释放后细胞映射的变化

为了深入了解PAD4缺失对VSMCs转分化的影响，作者对混合的Tdtomato+细胞和ZsGreen+细胞进行了scRNA-seq。质控后，共获得35,511个细胞，降维聚类后得到10个Cluster。scRNA-seq结果显示，在VSMCs PAD4缺陷时，Tdtomato+细胞表达格局发生了巨大变化，而ZsGreen+细胞映射的演变则微乎其微（图4h-j）。

作者对Tdtomato+细胞进行亚聚类获得了10个cluster（图4K、L），敲除PAD4后，衰老VSMCs的比例显著减少(图4m)。衰老VSMCs聚类显示Vcam1和Ccl2高表达，GO富集分析结果为“SMC凋亡进展”，SMCs标记基因在“平滑肌细胞分化”中富集，纤维肌细胞和纤维软骨细胞(有益细胞)的标记基因在“肌肉结构发育”中富集，参与斑块稳定过程。此外，PAD4 (hi) CD68+ SMC、CD68+ SMC和衰老SMC簇的标记基因在“炎症反应到损伤”(图5a所示)中富集，产生炎症和不稳定。根据一系列发现作者得出结论，抑制cd68阳性VSMCs的ETs促进了B6-G/R Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠斑块发展过程中VSMCs向有益细胞的转分化。

作者筛选了从B6-G/R Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠(Pad4^Δ/Δ Tdtomato+细胞)中获得的Tdtomato+细胞与从B6-G/R Myh11^Cre小鼠(Pad4+/+ Tdtomato+细胞)中获得的Tdtomato+细胞的不同表达基因(DEGs)(图5b)。GSEA显示B6-G/R Myh11^Cre Tdtomato+细胞中，“toll样受体信号通路”、“STING信号通路”和“TNF信号通路”产生了富集。

随后，作者对H3CIT + dsDNA组和bsa处理对照组的rasmc进行了批量RNA测序分析。图5c, d显示了两组细胞之间不同的基因表达模式。作者在oxLDL刺激的不同时间点用H3CIT和dsDNA处理RASMCs，发现H3CIT中STAT3的磷酸化被抑制，而dsDNA与对照组相比，STING上调(图5e-g)。接着作者发现Socs1是STING信号通路激活后抑制STAT3磷酸化的关键调控因子。IF染色显示Ki67+ Tdtomato+ SMCs比例降低。此外，抑制ETs释放后，体内Socs1表达的IF染色显著降低(图5l, m)。

RASMCs中TLR4- myd88信号通路也被激活(图5h-j)， B6-G/R Myh11^CrePad4^flox/flox小鼠斑块抑制ETs释放后，TLR4调控的下游蛋白GSDMD减少(图5k, n, o, )，在B6-G/R Myh11^Cre小鼠的VSMCs中，tlr4诱导SMCs增殖，这与之前的scRNA-seq结果一致。

作者研究表明，CD68+ VSMCs产生的ETs不利于斑块的进展，并强调了它们在斑块稳定中的意外作用。这些发现也为VSMCs转分化为不同的中间有害和有益亚型提供了见解，这些亚型可能影响斑块的组成，并可作为预防斑块的新治疗靶点。

DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-35330-1

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排版人：小久

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