酵母三杂交 | 植物中蛋白质复合体功能研究案例解析

光敏色素是调节植物生长发育的光感受器，比如将幼苗放在单侧光阳台上，它会快速向光弯曲生长，就是受光敏色素调控的。种子植物主要有两种光敏色素，红光受体的phyB和远红光受体phyA。光敏色素在非活性状态下定位于细胞质中，在转化为活性Pfr状态后易位到细胞核中。弗莱堡大学的Hiltbrunner团队在elife发表的“Uncovering a novel function of the CCR4-NOT complex in phytochrome A-mediated light signalling in plants”研究结果，发现在黑暗条件下（FR），NOT9B与CCR4-NOT形成复合体，抑制下游光诱导基因表达；光照条件下与迁移到细胞核中的phyA互作，脱离CCR4-NOT复合体，促进下游光诱导型基因表达。

本研究首先通过酵母双杂交筛选，在拟南芥文库中筛选到与phyA诱饵蛋白互作的蛋白NOT9B，且发现NOT9B与光激活状态的Pfr互作更强。通过敲除和过表达实验，检测NOT9B在光信号通路中的功能，发现NOT9B是幼苗早期发育的负调控因子，特异性作用于phyA的下游信号。通过序列分析，发现NOT9B与酵母CAF40和人的CNOT9（CCR4-NOT复合体的核心组分）高度相似，进一步通过Y2H等验证了NOT9B与NOT1间的相互作用，并通过蛋白分段检测发现，NOT1和phyA在NOT9B中有一个共同的结合位点。进一步通过酵母三杂交探讨NOT1与phyA是否竞争性结合NOT9B，结果发现NOT1-M和NOT-DUF可以抑制NOT9B-pyhA互作，进一步分析phyA在细胞核中含量的动态变化，推测phyA对NOT1-NOT9B互作影响更大，说明phyA、NOT1与NOT9的互作存在竞争性。这些发现为理解光信号如何进入真核生物的中心生命进程提供了基础。

外囊复合体在植物免疫中是一种媒介，由8种亚基组成，负责在胞吐早期将高尔基分泌囊泡导向到质膜特定位置上，在植物免疫应答反应中起重要作用，与此同时，该复合物的组成部分也是各种病原体的目标。EXO70是8亚基之一，存在23种同源基因。

对于大多数革兰氏阴性菌，其致病性很大程度上依靠高度保守的III型蛋白分泌系统(T3SS)，该系统将效应蛋白（毒力蛋白）输送到真核宿主细胞中，干扰宿主细胞的各种免疫反应。在野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris，黑腐病病原体）中，有三种效应蛋白：XopP、XopF和XopAL1，统称为Xops。2022年，the Plant cell上发表的“The host exocyst complex is targeted by a conserved bacterial type III effector protein that promotes virulence”研究报道中，揭示了野油菜黄单胞菌的保守T3EP XopP蛋白通过与拟南芥外囊复合体组分互作，抑制宿主胞吐和免疫应答反应，实现细菌侵染植物的分子机制。

本研究首先构建了24个保守的拟南芥NLR-IDs蛋白于pGBKT7载体，以及13个细菌效应蛋白于pGADT7载体，通过酵母双杂交筛选实验获得互作组，其中包括EXO70B1与XopP互作组。并通过对同源基因的互作检测，发现EXO70B1与XopP的互作是特异性的，其与XopP同源蛋白不互作，但EXO70F1与XopP1存在互作。另外，通过BiFC对筛选到的互作组进行植物细胞内验证，发现XccXopP似乎与两个以上外囊复合体均有互作，基于此，研究者提出假设，XccXopP可能作为两种外囊复合体亚基组装的抑制因子起作用，为了验证此假设，通过酵母三杂交进行了验证，结果发现XccXopP可以作为抑制因子，阻止亚复合体I与亚复合体II形成功能性复合体，干扰宿主胞吐和免疫应答反应。本研究证明了外囊体组分是植物易感黑腐病组分，为抗细菌植物的开发提供了靶点依据。

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