Redox Biology: 苏州大学苏州医学院研究团队发现脑出血后内源性H2S是调控小胶质细胞持续吞噬的关键因子

苏州大学苏州医学院药学院贾佳教授、苏大附一院神经外科陈罡教授和苏大神经科学研究所程坚教授近期合作在Redox Biology期刊发表题为“Endogenous H₂S targets mitochondria to promote continual phagocytosis of erythrocytes by microglia after intracerebral hemorrhage”的研究论文。脑出血后，血肿是导致原发性和继发性脑损伤的关键因素。血肿主要组分是死亡红细胞。脑出血后脑内吞噬细胞， 如小胶质细胞对血肿红细胞的吞噬是血肿清除的关键。现有血肿清除的研究主要关注：吞噬细胞与红细胞表面受体和配体的相互识别以及结合。然而，体内吞噬细胞的数目远少于被吞噬的死亡细胞。因此，单个吞噬细胞能否持续性吞噬死亡细胞至关重要。但目前尚不了解脑出血后吞噬细胞持续吞噬红细胞的内源性调控机制。该研究表明CBS催化生成的H₂S可能是一种目前尚未认识到的脑出血后持续吞噬的调节因子。

图1. 脑出血后小胶质细胞中CBS介导的H₂S合成上调

该研究向小鼠左侧纹状体注射胶原酶或自体血建立动物脑出血模型，并用红细胞裂解液处理原代小胶质细胞建立细胞脑出血模型。通过这些模型，并利用Western blot、免疫荧光染色等技术在动物和细胞水平检测内源性H₂S合成酶CBS表达量的变化，该研究首先发现脑出血后红细胞裂解组分促进小胶质细胞中CBS蛋白水平升高，相应地也促进内源性H₂S合成。

图2. 小胶质细胞CBS通过H₂S介导的机制促进脑出血后血肿的自发清除

随后，研究人员利用小胶质细胞特异性敲除CBS的基因小鼠（Cx3cr1^Cre:Cbs^fl/fl）进一步确认脑出血后血肿的自发清除依赖于小胶质细胞中CBS-H₂S合成途径。

图3. 小胶质细胞CBS以H₂S依赖的方式促进持续吞噬红细胞

接下来，研究人员利用Annexin V阻断死细胞外化的PtdSer与其受体之间相互作，用ZnCl₂阻断游离H₂S的作用，这两种阻断剂都能抑制用红细胞裂解液处理的小胶质细胞对红细胞的吞噬。进一步，在连续吞噬细胞模型中，研究人员发现内源性 CBS缺失损害了持续的吞噬作用，而不影响第一轮吞噬作用。因此，CBS催化合成的内源性H₂S促进了小胶质细胞对血肿红细胞的持续吞噬。

图4. CBS催化生成的H₂S通过SQR作用促进脑出血后小胶质细胞吞噬和血肿清除

已有研究表明线粒体膜电位(ΔΨm)的降低显著能显著促进持续吞噬。研究人员在细胞模型中进一步发现在红细胞裂解液处理的小胶质细胞中，CBS来源的内源性H₂S降低了ΔΨm。研究员利用小胶质细胞特异性敲除硫醌氧化还原酶（SQR）的基因小鼠（Cx3cr1^Cre:Sqr^fl/fl）及敲除SQR的原代小胶质细胞发现：SQR通过对CBS来源的内源性H₂S的氧化驱动线粒体复合物I水平的反向电子转移，从而产生线粒体ROS激活解偶联蛋白（UCP2）而降低线粒体膜电位(ΔΨm)，进而促进脑出血后小胶质细胞对红细胞的持续吞噬。

图5. SQR通过线粒体复合物Ⅰ产生的ROS氧化CBS催化合成的H₂S促进自发血肿清除

与敲除CBS的小胶质细胞相比，红细胞裂解液可上调WT和对照组小胶质细胞的线粒体ROS水平。此外，线粒体靶向ROS清除剂MitoTempo阻断了红细胞裂解液对红细胞小胶质细胞吞噬的促进作用，进一步表明内源性H₂S促进红细胞小胶质细胞吞噬需要线粒体ROS。研究人员利用表达shRNA的慢病毒敲减小胶质细胞中线粒体复合体I亚基NDUFS3。在小胶质细胞中敲减NDUFS3减弱了红细胞裂解液诱导的线粒体ROS上调。因此得出结论SQR氧化内源性H₂S通过启动复合物I反向电子传递提高线粒体ROS。

图6. 内源性H₂S通过ROS激活UCP2促进小胶质细胞吞噬红细胞和脑出血后自发性血肿清除

利用UCP2抑制剂Genipin抑制ROS激活UCP2的作用，研究人员发现Genipin在阻断红细胞裂解液诱导的膜电位降低的同时，可抑制小胶质细胞对红细胞的吞噬。利用慢病毒在纹状体敲减UCP2，研究人员发现UCP2敲减延迟了自发性血肿的清除和功能恢复,而H₂S供体ADT并没有挽救这种延迟。

图7. 靶向CBS-H₂S途径加速高同型半胱氨酸血症小鼠血肿清除

最后，该研究初步探索了高同型半胱氨酸血症是如何加剧脑出血。研究员通过膳食中补充蛋氨酸诱导小鼠高同型半胱氨酸血症。Western blot结果显示高同型半胱氨酸血症抑制脑出血后CBS的诱导表达。与对照组小鼠相比，饲喂蛋氨酸的小鼠在脑出血后显示出更大的残余血肿体积和更严重的神经缺损，在喂食蛋氨酸的基础上造模后给予5a和ADT（能加速血肿清除并改善脑出血后喂蛋氨酸小鼠的神经功能缺损）。

总之，该研究提供证据表明CBS-H₂S-复合物I途径对脑出血后细胶质细胞持续吞噬能力至关重要。此外，靶向CBS-H₂S途径可能是一种有前途的治疗脑出血伴高同型半胱氨酸血症的方法。该论文受国家自然科学基金项目(81971119,82071469,81571124,81671310);江苏省高等学校重点学科建设研究苏州市神经疾病临床研究中心(Szzx201503);江苏省重点实验室资助项目(BM2013003)资助。

本文所用慢病毒LV-NDUFS3-shRNA、LV-UCP2-shRNA及对照病毒均为吉凯基因提供，研究员将病毒注射入纹状体成功实现靶蛋白在特定脑区域的敲减，助力高水平的科学研究。

苏州医学院药学院贾佳教授、苏大附一院神经外科陈罡教授和苏大神经科学研究所程坚教授为本文共同通讯作者，苏州医学院研究生闫晓玲、何梅俊和黄汇为论文的共同第一作者。