2022-09-20 10:40:05, 搬砖小陈 上海吉凯基因医学科技股份有限公司
生物的遗传密码由基因组携带,基因组在复制过程中,或者经由外界物理或者化学的刺激会发生突变。这些突变多数位于基因间,因此大部分是无害的。一部分位于基因内部的突变可能导致基因的表达水平或者蛋白发生变化,其中典型的就是无义突变,该种突变是某个碱基的氨基酸密码子突变为终止密码子,从而使肽链合成提前终止,占据大约三分之一的导致人类遗传疾病的点突变中。
既然肽链合成提前终止了,那就无法产生全长的氨基酸链,而这种改变又不像错义突变那样引入差异的氨基酸,等于是表达了原始蛋白的一段序列,那其功能学会如何变化呢?
SOX10不同位置无义突变的功能学模型
SOX10 是一种转录因子,在其 C 末端3包含一个中央高迁移率基团 (HMG) DNA 结合结构域和一个反式激活结构域。SOX10 对神经嵴谱系细胞的发育至关重要,包括黑素细胞和肠神经节神经元,SOX10的截断突变导致称为 PCWH 的复杂神经嵴病。Ken2等人研究表明:导致疾病不太严重的突变体mRNA(WS4)稳定性降低,这表明潜在的机制是单倍体不足;相比之下,更严重的神经系统疾病似乎是由稳定的mRNA突变体引起的,该 mRNA 被翻译成具有强显性负活性的突变蛋白(某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能,还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信号转导蛋白的作用,主要通过和野生型蛋白形成二聚物的方式实现(异源二聚化,heterodimerization)。这种突变比无效突变和无效等位基因突变毒性作用更大。这种作用被称为显性负性作用)。
同样是无义突变,同样是产生截断性蛋白,为什么表型差异如此之大?作者分析了与 WS4 表型相关的显性阴性突变体在内部外显子(外显子3 和 4)中具有无义突变,而与 PCWH 相关的那些在最终外显子5中具有无义突变。因此,猜测位于内部外显子中的无义密码子可能会触发 mRNA 衰变,从而减少显性失活蛋白的数量。
于是使用包含内含子 4 的minigene构建体来验证这一假设,内含子将SOX10的最后两个外显子分开。Northern-blot 分析表明,内含子上游的无义突变(Y83X、E189X或Y207X)导致 mRNA 水平降低,而内含子下游的无义突变(Q250X或 795delG)不会导致mRNA的这种减少。这些结果支持作者的假设,即WS4相关突变,而不是 PCWH 相关突变,导致mRNA减少,从而防止显性负效应。
为了确定 SOX10 突变蛋白干扰野生型 SOX10 功能的能力,作者将高表达突变体和野生型 SOX10 的载体一起共转染到U138 人胶质母细胞瘤细胞中,通过荧光素酶分析SOX10发挥正常功能的活性(绿色显示的突变导致 WS4,红色显示的突变导致 PCWH):
所有突变体都显示出相对于野生型 SOX10 的转录活性降低,表明大多数截短的 SOX10 突变体具有降低的转录活性和显性负效应。只有两个 WS4 相关突变体(482ins6 和 1076delGA)显示出与野生型 SOX10 相似的附加转录激活效应,在表型上,确实这两种突变不明显变化。
作者用电泳迁移率 (EMSA) 来进一步研究截短的 SOX10 突变蛋白的显性负活性的分子机制。与野生型 SOX10 相比,所有保留完整 HMG 结构域的突变体都具有增强的表观 DNA 结合亲和力,从而干扰了野生型 SOX10 的 DNA 结合:
上述实验表明,引发两种模型的机制在于虽然同样都是显性负性蛋白,但一个快速降解,一个跟野生型一样正常表达,但为何mRNA中间的突变容易降解,而最后一个外显子的突变降解速度慢?
NMD机制
细胞拥有多种检测和处理缺陷基因产物的监测机制,比如,无义介导的 mRNA 衰变 (NMD) 是一种细胞监视机制,可降解含有过早翻译终止密码子的转录本,问题是该机制将错误的翻译与正常的翻译相区分的呢?
在哺乳动物 NMD 机制中,由于剪接事件,内含子去除时在外显子-外显子连接处的 mRNA 上留下一个“标记”,作为触发 NMD 的信号。这种称为外显子-连接复合物 (EJC) 的标记使NMD监视途径能够区分提前终止密码子(PTC)和最后一个外显子中存在的正常终止密码子,确保仅降解含有无义密码子且后跟内含子的转录本。但哺乳动物 NMD 监测系统无法区分倒数第二个外显子中距最终内含子小于55个碱基对的 PTC1。倒数第二个外显子 3'' 末端的“ ~ 55 bp 规则”被认为反映了 EJC 在剪接的 mRNA 上的位置。只有几个基因的 mRNA 降解似乎显示出此规则的例外情况,包括 hexoseaminidase A ( HEXA )3, MPZ ,髓鞘蛋白4, HNF-1β(肝细胞核因子-1β)5和T细胞受体(TCR)6。
所以,即便都是无义突变,但是突变的位置根据NMD的机制,会导致同一基因的突变表现出不同的性状,远离最后一个外显子以及倒数第二个外显子末端55bp的突变,会触发NMD机制,引发错误蛋白翻译的RNA快速降解,避免截断型蛋白大量表达影响野生型蛋白的功能;反之的无义突变,会逃脱NMD的监控,导致大量截断型蛋白的表达,从而表现出强烈的显性负性作用,目前已知严重的疾病跟错义突变相关的,突变位置都基本靠后。
不同基因无义突变位置导致的差异型表型
因此,在基因含有多个无义突变的基因型时,可以优先选择远离最后一个外显子的突变类型,更容易做出功能表型;也可以根据突变的位置大致判断无义突变对功能的影响。吉凯基因可以提供minigene、截断型设计、构建一条龙服务,感兴趣的老师快来咨询吧!!!
【参考文献】
1.Nonsense-mediated mRNA decay modulates clinical outcome of genetic disease
2.Molecular mechanism for distinct neurological phenotypes conveyed by allelic truncating mutations
3.Nonsense-mediated decay of human HEXA mRNA
4.Molecular mechanism for distinct neurological phenotypes conveyed by allelic truncating mutations
5.The position of premature termination codons in the hepatocyte nuclear factor -1 beta gene determines susceptibility to nonsense-mediated decay
6.Boundary-independent polar nonsense-mediated decay
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