单细胞测序样本制备系列——肝脏组织篇

肝脏是消化系统中最大的消化腺，也是人体内脏中最大的器官，位于人体的腹部位置右侧横隔膜之下。作为消化器官，肝脏参与糖、脂类、蛋白质三大基本物质的代谢，同时，作为人体内最大的解毒器官，肝脏不仅可对多种来源的毒物和废物以及对肝脏有毒性的药物等进行解毒并以无害物质的形式分泌到胆汁或血液排出体外，而且还有造血和凝血等作用。

肝小叶是肝结构和功能的基本单位，肝小叶以中央静脉为中心，肝板、肝血窦围绕中央静脉呈辐射状分布。肝脏的细胞组成主要包括肝实质细胞（即肝细胞）和非实质细胞（贮脂细胞（Ito细胞），血窦内皮细胞，Kupffer细胞，陷窝细胞，巨噬细胞等）。

肝脏是单细胞测序的常见样本类型，由于肝脏里面微血管含量丰富，一般对于动物肝脏取材，灌注以后效果会更好一些，不灌注直接取材，微血管里的血液凝血后会带有大量的游离免疫细胞，后续无法通过清洗获得理想效果，导致免疫细胞占比增加。对于肝脏样本，吉凯基因拥有丰富的样本处理经验，平台新鲜取材，加入EDTA-PBS里，通过在有抗凝血作用的缓冲液中剪碎后清洗的方式，也能获得跟灌注相似的结果。下面就让我们跟着小编一起来涨姿势吧！

实验目的：

将肝癌样本分离，制备单细胞悬液，用于后续单细胞测序。

实验准备：

样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好相应酶液。

【酶液】：

2mg/ml     collagenase IV

1mg/ml     collagenase I

0.02 mg/ml   DNase I

30 U/ml     hyaluronidase

5% FBS

0.6% bovine serum albumin (BSA)

HBSS

实验步骤：

1. 将组织倒入培养皿中，加入清洗液，摇晃清洗后弃去，共清洗三次；

2. 完全弃去清洗液后，加入配置好的酶液，使用干净的剪刀将组织完全剪碎；

3. 待组织完全剪碎后，用移液器将每组剪碎的组织移到 15ml 离心管内；

4. 将装有组织的离心管放置在 37℃摇床上消化 30min，30min 后吸上清过滤，加入新酶再消化 30min；

5. 待消化结束，将各组消化液转移至 50ml 离心管，补清洗液至 40ml，将其通过 40μm 滤器转移至新 50ml 离心管，300×g 离心 5min；

6. 弃去上清，加入红细胞裂解液 1ml 重悬裂解红细胞，裂解时间 3min；

7. 加入 10ml 清洗液终止裂解并清洗细胞，300×g 离心 5min 后清洗液重悬；

8. 加入新的清洗液，300×g离心 5min 清洗细胞两次后对悬液进行质检。

实验目的：

将小鼠肝脏样本分离，制备单细胞悬液，用于后续单细胞测序。

实验准备：

样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好相应酶液。

【酶液】：

1mg/ml      collagenase IV

0.5mg/ml     collagenase I

0.02 mg/ml   DNase I

30U/ml      hyaluronidase

0.6% bovine serum albumin (BSA)

5% FBS

HBSS

实验步骤：

1. 将组织倒入培养皿中，加入清洗液，摇晃清洗后弃去，共清洗三次；

2. 加入清洗液，300×g，5min 离心清洗；

3. 弃去清洗液后，加入适量消化液，混匀消化；    

4. 取20uL消化悬液进行台盼蓝染色镜检，观察细胞，免疫细胞占比较多，肝实质细胞剪碎后发现部分细胞死亡处理后占比较少；

5. 用封口膜将离心管封好，将样本放置在37ºC摇床消化20min；

6. 20min后，还未消化完全，吹打混匀后继续消化5min；

7. 5min后观察消化效果，发现组织基本消化。

8. 将消化液通过100μm，40um滤网转移至50mL离心管内， 300×g 离心5min；

9. 弃去上层液体，加入2mL红细胞裂解液轻柔吹散细胞，静置3min；

10.加入清洗液至10ml终止裂红，300×g 离心5min；

11. 弃去上清，加入适量清洗液重悬混匀，分别取20ul进行AO/PI计数及台盼蓝镜检。

样本：人肝癌组织

细胞活率：91.2%

活细胞浓度：3.26E+05/ml

结团率：9.7%

样本：小鼠肝脏组织

细胞活率：93.16%

活细胞浓度：9.55E+05/ml

结团率：3.54%