For Better PROTACs：蛋白质组学在药物研发中的应用

2022-09-15 03:19:34, 生物医药事业部上海中科新生命生物科技有限公司

小编的上一篇文章为大家介绍了PROTAC的技术原理和最新行业进展（小分子创新药的又一春？--PROTACs药物研究系列之一），这一篇文章则主要讨论医药同仁们在PROTAC药物研发中的遇到的挑战和可能的解决方案。

PROTAC行业经历了20年的发展，成功从概念验证过渡到实际应用阶段，但仍有许多问题和挑战亟需解决。

目前最主要的挑战来自于2个方面：

1)分子设计和成药性优化，包括小分子配体的设计、新型E3配体的设计、linker的设计、分子量过大导致的透膜性和生物利用度差、hook效应等；

2)分子的生物活性评价，包括高通量分子筛选、PK/PD评估、降解活性、脱靶效应等。

尤其PROTAC特异性的药效评价及脱靶效应带来的毒性风险，成为PROTAC药物研发亟待突破的“关键瓶颈”。

定量蛋白质组学

评估PROTAC脱靶效应的有力工具

不论是RNAi、细胞治疗、小分子靶向药，还是PROTAC技术，由脱靶效应所导致的细胞毒性都是需要重点关注的问题。但考虑到基因靶向药和小分子抑制剂等都只是对蛋白活性进行抑制，残留的蛋白活性也可以支撑细胞和器官的基本生理功能，如此便可降低潜在毒性。但PROTAC药物是直接对靶蛋白进行完全降解，一旦脱靶便会让蛋白彻底失活，由此带来的细胞毒性和潜在风险就大得多。

脱靶效应带来的细胞毒性在临床前的安全性评价试验和毒性筛选试验中并不易被发现和检测到，由此也增加了药物后期开发的风险。

2010年，日本学者终于发现半个世纪前导致“海豹儿”事件的沙利度胺的致畸原理，在于这一药物会和与 Cullin RING E3 泛素连接酶 CUL4-RBX1-DDB1-CRBN (CRL4CRBN) 结合并促进关键靶点，如锌指 (ZnF) 转录因子 IKAROS (IKZF1)、AIOLOS (IKZF3) 和ZFP9的泛素化，进而导致这些蛋白的降解。基于此，诺华公司研发负责人James Bradner在2015年的《Science》刊登了基于沙利度胺类似物结构的新一代PROTAC分子，引起业界轰动，CRBN E3酶受体也成为了现下使用频率最大的PROTAC分子骨架之一^[1]。但沙利度胺的生殖毒性也警醒研究者对PROTAC的毒性评价工作必须更加谨慎客观。当分别使用沙利度胺及其衍生物来那度胺和泊马度胺对胚胎干细胞进行处理(图1)^[2]，用Mass Spectrometry-Based的蛋白质组学技术对药物处理后的细胞系内近1万种蛋白进行高通量定量分析，发现除了既定靶标SALL4蛋白丰度出现明显下降外，还有多个其他蛋白（FAM83F, RAB28, CSNK1A1， ZBTB39, ZFP91，DTWD1和WIZ)也出现了不同程度的降解。而这一脱靶现象在使用不同细胞系进行相同的药物处理时均有发现。且在不同的细胞系中，脱靶蛋白的种类、数量和丰度都有所不同。因此，在PROTAC分子骨架设计时，不论是使用CRBN配体，还是使用其他E3酶配体，都需要对其潜在的脱靶蛋白进行前置分析。而定量蛋白质组学可以对细胞系内六千种以上蛋白进行全局高通量、高灵敏度的鉴定与定量分析，最大程度发现药物作用后细胞的响应位点和影响范围，是PROTAC分子脱靶分析的有力工具。

图1：对沙利度胺/来那度胺/泊马度胺处理后的细胞系进行基于定量蛋白质组学的脱靶分析^[2]

泛素化蛋白质组学

综合评估泛素化位点和降解特异性

PROTAC药物一个重要的应用方向是，基于E3连接酶的肿瘤/细胞/组织特异性，实现PROTAC的精准靶向蛋白降解（precision TPD）。如目前应用较多的VHL E3连接酶，在人血小板中的表达量很低，但在多种人类肿瘤细胞中均检测到VHL的高水平表达，利用VHL E3酶的这种“反向特异性”，可以将具有剂量限制毒性的抗肿瘤药物转化为组织特异性、毒性较低的PROTAC分子。由美国制药企业艾伯维公司(AbbVie)研发并上市的ABT199是一种新型BCL-2抑制剂，但是，可以同时抑制BCL-2和BCL-XL的双抑制剂ABT263却因为对BCL-XL的靶向毒性会杀死血小板细胞、导致剂量限制性血小板，而无法上市。为了开发能够抑制BCL-XL活性、但又不会对血小板产生毒性的抗肿瘤药物，一篇刊登在《Nature medicine》的文章中描述了一种经VHL招募弹头融合ABT263而成的PROTAC分子（DT2216），不仅抗肿瘤活性高于ABT263,更可大大降低血小板的毒性(图2，A)^[3]。

为了验证DT2216的细胞特异性，研究者使用细胞培养条件下稳定同位素标记技术 (SILAC) 和基于液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 的蛋白质组学技术，分析经DT2216和DT2216NC（不能和VHL结合的阴性对照组化合物）处理后细胞中蛋白质的变化。SILAC/LC-MS/MS结果显示（图2）， DT2216可以显著降低BCL-XL的蛋白丰度，但这两种药物均不影响任何其他蛋白质的表达，证明DT2216的确是一种特异性BCL-XL PROTAC。

为了进一步确认泛素化的位点，利用泛素化蛋白质组学对BCL-XL内的特异性泛素化位点进行检测。将293T 细胞与 Flag-BCL-XL 和 HA-泛素载体进行共转染，利用抗Flag亲和树脂对提取物进行免疫沉淀，然后用胰蛋白酶和AspN酶进行水解消化，随后对降解后的修饰肽段富集，用Tandem Mass Spectrometry进行检测分析。图2为BCL-XL的泛素化肽EVIPMAAVKQALR的片段化图谱，通过对其一级和二级图谱的分析，可以确定BCL-XL蛋白的泛素化位点为 Lys 87 残基。

图2：基于泛素化蛋白质组学对DT2216的细胞特异性和BCL-XL的泛素化位点进行分析^[3]

由此，基于Tandem Mass Spectrometry平台的泛素化蛋白质组学，可以精准确定靶蛋白或疑似脱靶蛋白上发生修饰的肽段及其修饰位点，对其泛素化水平进行评估，确认基于E3酶的药物作用机制。

行业展望

PROTAC技术的面世，为小分子创新药行业带来了新的春天，尤其是在针对“不可成药”靶点和“耐药性”方面，更是被寄予极大的期望。目前尚未有任何一款PROTAC分子药物面世，研发过程中也还存在着许多技术挑战，但目前取得的初步成果依旧令大家对这一新兴技术和治疗策略充满希望，也令这一行业成功受到资本市场的追捧。我们期待越来越多设计巧妙、满足临床需求的PROTAC分子的面世，使得更多的患者受益、更多的疾病得到有效治疗。

参考文献

[1] GEORG E. W, DENNIS L. B. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation [J]. Science, 2015.

[2] DONOVAN K A, AN J, NOWAK R P, et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome [J]. Elife, 2018, 7.

[3] KHAN S, ZHANG X, LV D, et al. A selective BCL-XL PROTAC degrader achieves safe and potent antitumor activity [J]. Nat Med, 2019, 25(12): 1938-47.

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