项目文章Blood（IF 20.3）| 中科院上海营养与健康研究所利用TMT标记蛋白组学助力白血病机制研究

人骨髓基质细胞系HS-5，  小鼠骨髓基质细胞系MS-5， 健康人的BMSC，AML患者的BMSC， AML小鼠骨髓间充质干细胞， AML小鼠骨髓液

为了确定Id1在BMM中的作用，研究团队通过qPCR和Western blot检测分析Id1在HSC和不同类型的BMM细胞中的表达模式。结果显示Id1在HSC和几种BMM细胞中均有表达，Id1在MSCs的mRNA和蛋白水平高于其他组(图1A-B)。由于Id1在BMM细胞中高度表达，因此进一步确定Id1是否通过非细胞自主作用调节白血病。qPCR和Western blot分析HD-MSCs和AML-MSCs，检测结果显示AML-MSCs的ID1 mRNA和蛋白水平高于HD-MSCs(图1C-E)。为了了解是否所有AML亚型的MSCs中ID1水平都增加了，接下来将HS-5细胞与不同基因组成的白血病细胞进行共培养试验 (图1F)。4天后，从共培养系统中收集HS-5细胞，并进行qPCR和蛋白质印迹分析。与CD34⁺ 细胞相比，观察到与M2亚型AML细胞(Kasumi-1、HL-60、SKNO-1)和M5亚型AML细胞(THP-1、MOLM-13、MV4-11、NOMO-1)一起培养的HS-5细胞中ID1表达水平显著升高(图1G-H)。为了进一步验证ID1在这两种AML-BMM亚型中的作用，进行了体内二次移植试验。将2×10⁴个AML1-ETO9a (AE9a)或MLL-AF9的白血病细胞移植到亚致死剂量照射的受体体内(图1P)。移植两周后，使用qPCR和Western blot分析AML小鼠和对照小鼠的BMM细胞。结果显示Id1在AML-BMM的mRNA和蛋白水平较高，特别是在MSCs中表达水平最高(图1Q-S)。综上所述， ID1在AML1-ETO/MLL-AF9诱导AML中潜在的非细胞自主作用。

BMSC细胞系HS-5，MS-5和OP9是用于体外促进HSPC扩增或分化的关键基质细胞系。使用体外共培养系统的模型进一步研究了ID1在AML中的非细胞自主作用。用sgRNA和shRNA靶向ID1，发现HS-5、MS-5和OP9细胞中ID1在蛋白水平上显著表达(图2A)。将Kasumi-1、SKNO-1、THP-1和MOLM-13细胞与HS-5细胞共培养了4天(图2B)，MTT检测结果表明，HS-5细胞中ID1的缺失显著抑制了AML细胞的非细胞自主增殖(图2C-F)。接下来作者试图评估Id1在亚致死剂量照射受体小鼠AML进展中的非细胞自主作用(图2L)。AE9a (n=9)或MLL-AF9 (n=10)细胞系的Id1^-/-小鼠比Id1^+/+组具有更长的寿命(图2M)。因为这些细胞是荧光素酶阳性的，在移植后，与Id1^-/-受体相比，在Id1^+/+小鼠中检测到更强的生物发光信号(图2N)。总之，BMSCs中的Id1敲除主要抑制AML细胞系的生长，并诱导这些细胞中的细胞周期停滞。

为研究AML患者Id1^+/+和Id1^-/-在髓上清液(BMSF)中的蛋白质变化，基于TMT标记白质组学(图3A)。在每个样品中定量了6973种蛋白质，其中鉴定到371种差异表达的蛋白质。热图显示BMSF蛋白质组中前20种下调和上调的分泌蛋白(图3B)。对于Id1^-/- BMSF中的下调因子，使用qPCR验证了这些蛋白在AML患者中的表达，AML-BMSCs中Angptl7 mRNA水平上调(图3C)。进一步用ELISA、Western blot和qPCR检测来评估AML患者骨髓液和MSCs中ANGPTL7的水平，发现与健康个体相比，AML样本中ANGPTL7水平显著增加(图3D-E)。

SP1是一种高度表达的转录因子，作者发现在与Kasumi-1细胞共培养的HS-5细胞中，ID1的缺失降低了SP1的蛋白水平，但没有降低其mRNA水平。与之相反，ID1过表达增加了SP1蛋白水平，但没有增加mRNA水平(图4A-C)。敲除与THP-1细胞共培养的HS-5细胞中ID1降低了SP1的蛋白水平。ID1的过表达增加了SP1蛋白水平，不是mRNA水平(图4D-F)。总之，敲除与AML细胞共培养的HS-5细胞中的ID1，显著降低SP1蛋白水平，随后抑制ANGPTL7转录。

为了研究阴性DNA结合因子ID1是如何调节SP1蛋白水平的，作者使用质谱进行ID1相互作用组分析。使用抗HA抗体免疫沉淀与表达MLL-AF9的白血病细胞共培养4天的MS-5细胞的全细胞裂解物，硝酸银染色分析显示HA-Id1被免疫沉淀。鉴定到与HA-Id1相互作用的Sp的泛素E3连接酶Rnf4(图5A)。将pCMV-RNF4-FLAG质粒转染到表达HA-ID1的HS-5细胞和对照细胞，和免疫共沉淀试验证实HA-ID1和RNF4之间的相互作用(图5B-C)。随后进行GST下拉分析，显示出ID1和RNF4之间的直接相互作用(图5 D)。随后，在RNF4的shRNA或对照shRNA转导的HS-5细胞中，分别使用qPCR和蛋白质印迹分析检测RNF4和SP1的表达。RNF4显著下调，SP1蛋白上调但不影响ID1蛋白(图5E)。为确定ID1-RNF4相互作用是否影响SP1蛋白，进行GST下拉分析，并检测到在HA-ID1存在下GST-RNF4结合SP1的量显著减少(图5F)。

为了更好地证实ID1调节AML-BMM中的ANGPTL7以维持LSC并影响体内AML进展，研究团队进行Angptl7股内注射。在治疗后，Angptl7治疗的Id1^-/-白血病小鼠的存活率在AE9a和MLL-AF9衍生的白血病中显著缩短(图6A-B)。BM流式细胞仪分析显示，未经Angptl7处理的Id1^-/-受体的脾和PB细胞含有较少百分比的GFP⁺c-Kit⁺白血病原始细胞，并显著降低了MLL-AF9驱动的白血病中L-GMP细胞的百分比(图6C-H)。总之，数据表明Id1调节Angptl7促进白血病的发展。

更多合集推荐

蛋白业务线：

4D系列 | DIA系列 | 临床大队列系列 | 非靶向蛋白质组外泌体多组学系列 | 靶向蛋白质组 | 单细胞蛋白组 | 磷酸化修饰组 | 泛素化修饰组 | 酰化修饰组 | 糖基化修饰组 | 修饰蛋白质组 | 蛋白+修饰多组学 | 蛋白/修饰+代谢多组学 | 深度血液4D-DIA蛋白组 | Olink蛋白质组学 | 极微量蛋白质组学

代谢业务线：

医学代谢组 | 植物代谢组 | 非靶向代谢组学 | 靶向代谢组学 | 高通量靶向代谢组学 | 代谢流 | 空间代谢组学 | 代谢多组学 | 脂质组 | 非靶代谢plus | HA2000 | 非靶脂质组学绝对定量plus

高通量测序业务线：

肠道微生物系统解决方案 | 单细胞测序专题 | 转录调控专题

研究领域：

标志物研究 | 宿主微生物研究 | 单细胞研究 | 蛋白基因组与分子分型研究 | 肿瘤 | 神经精神 | 妇幼 | 代谢疾病 | 植物 | 动科 | 中医药 | 食品