2022-09-15 00:13:42, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
代谢组学已经成为当今生物与医药领域的研究热点,其作为系统生物学的核心组学,与其他组学进行的系统性研究为中药作用机制研究提供了思路和方法[1]。代谢组学已经在临床疾病诊断及重大疾病的早期诊断等领域得到广泛应用。在代谢组学研究中最常采用的技术为核磁共振(NMR)和质谱(MS)分析技术。往往在实际应用中色谱分离技术,如气质(GC)、液相(LC)和毛细管电泳(CE),它们常与质谱串联起来分析。
基于气相色谱和液相色谱与高分辨质谱联用技术的分析策略主要有:目标化合物分析方法、非目标化合物分析方法和可疑化合物分析方法。如下图所示:
我们以中药黄芩为例,运用非靶向代谢组学手段结合Q exactive MS分析方法研究不同规格黄芩(枯芩和子芩)样品之间差异性的活性成分,研究思路如下图所示:
1)体外药材样品的制备
以中药材为例,样品的制备应根据样品自身的特性,优选最佳的提取方法(如超声提取、回流提取等)和溶剂。常用的提取溶剂为水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿等。
注意事项:前期样品制备方法可以采用单因素或正交实验进行条件优化;如果采用超声提取,应客观评判超声功率和超声时间引起水浴温度升高对提取样品的影响;应该充分评价提取样品所带来的操作误差对实验结果的影响。
2)生物样品的制备
生物样品主要包括体液(全血、血浆、血清、尿液、唾液和脑脊液等)、组织(脑、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、胰腺、小肠、大肠、肌肉和骨骼等)以及其它(毛发和粪便等)样品。不同类型样品前处理方式有所不同。常见的生物样品前处理方法:包括蛋白沉淀(PP)、液液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)法。
注意事项:应充分评价提取样品所带来的操作误差对实验结果的影响,有必要需设定质控样品;需考虑样品收集过程中稳定性问题,如尿液样品的收集,基质中酶、光照及温度对样品的影响;需考虑样品前处理过程中吸附性问题,如脑脊液(CSF)和尿液中因为蛋白含量较低,较易与样品收集管由于表面电荷产生相互吸附以及质控样品制备问题。
3)采集数据的预处理
目前,对于LC/GC-MS采集的数据进行预处理的软件非常之多,有免费开源的(如XCMS,MZmine和MetAlign等)、商业收费的(Markerlynx,MassHunter,ChromaTOF和ChemPattern 2.0等)和自主开发设计的编程软件(如Metlab)。每一种软件都有各自的优缺点,需要按照自己的目的或需求进行选择。
4)多元统计分析
代谢组学中运用的多元统计分析方法主要包括无监督分析(unsupervised analysis)方法(如PCA,HCA)和有监督分析(supervised analysis)方法(如PLS,PLS-DA,OPLS,和OPLS-DA)。
5)化学成分的解析
非靶标化合物分析方法基本流程为样品前处理的选择和优化、仪器分析(全扫描)、数据处理(预处理、多元统计分析)、目标化合物的二级图谱扫描、结构指认[5]。各厂家的高分辨质谱仪(HRMS)类型主要有Q-TOF,IT-TOF和Orbitrap等系列。其中,如Q Exactive MS是新型四级杆和轨道阱杂交HRMS,在分辨率、扫描速度和灵敏度性能上进一步提升,Q Exactive质谱仪能进行高通量的目标物或非目标物的筛选。
根据目标差异性成分MS数据进行MS/MS扫描,并结合数据库和文献报道对这些成分进行结构解析。
黄酮类成分ESI模式下常见的裂解规律
6)筛选目标成分的验证
一方面通过文献查证,对体内外发现的差异性成分的生物活性进行追踪;另一方面,需要进行不同批次样品给药的重复验证实验,个人推荐至少开展六个批次样品给药实验,以证明发现的含量差异性标志物的稳定性和可靠性。同时,可以采用直接购买相应的标准品,或自己分离制备,亦或自己合成等途径开展离体活性实验是一种很好的选择,比如常见的LPS诱导的细胞炎症模型,肿瘤细胞抑制实验等,并结合Western Blot,ELISA和RT-PCR实验进行表征。最后,所有的结果需要通过体内实验,运用药动学(PK)和药效学(PD)相关实验进行验证。
对于一个复杂体系来说,基于组学的方法不失为一种较为准确和精确的方法去鉴别体系中含有的活性成分或Biomarker。采用该方法主是以药物在靶器官或体液中的含量或浓度分布是药物发挥药效为前提条件。
12-02 Duncan Graham等
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