项目文章 | 中山大学附属第六医院研究团队运用多组学技术揭示剖宫产瘢痕憩室中宫颈微生物群与宿主基因调控的相互作用

接受剖宫产手术的女性可能会患上剖宫产瘢痕憩室 (CSD)。CSD是由于子宫局部切口愈合不良，形成与子宫腔相连的凹陷或空腔，可导致各种近期和远期并发症，之前的研究表明，持续性积液是影响 CSD 女性生育能力的主要因素。

女性生殖道具有独特的微生物组，在维持体内平衡和某些疾病的发展中起着至关重要的作用。当生态失调发生时，改变的免疫和代谢信号会产生相应的反应，包括慢性炎症、上皮屏障破坏、血管生成和代谢失调。之前的研究表明，CSD 持续性积液是由局部炎症和免疫失衡引起的，而局部微生物干扰在这一过程中起着核心作用。然而，局部微生物群活动的特征和微生物与宿主相互作用的机制仍然未知。在本研究中，将非靶向代谢组学和人类宿主转录组相结合，分析了CSD微生物的活性特征以及微生物与宿主相互作用的机制。

1、宫颈微生物群的多样性和组成特征

研究共纳入 52 名受试者，其中 CSD 组 28 名，CON 组 24 名。通过Shannon-Wiener指数计算的CSD组门（图1A）和属水平（图1B ）微生物群的α多样性显著高于CON组，表明CSD组的微生物组成显著高于CON组。CSD组更丰富。基于 Bray-Curtis 的 PCoA 图和 ANOSIM 分析显示，CSD 组样本之间的距离明显大于 CON 组（图 1C）。门水平的分类在两组之间显示出不同的模式，在CON组中厚壁菌门占绝大多数（图1D）。在 CSD 组中，厚壁菌门的比例下降到 62%，变形菌门和放线菌门的比例分别增加到 20% 和 10%（图 1E）。两组在属水平上的组成也呈现出显著差异。

本研究剖析了两组之间厚壁菌门和变形菌门的属组成。在厚壁菌门下， CSD组（图1F ）的乳酸菌比例较CON组（图1H）下降，而链球菌和肠球菌的比例增加， CSD 组（图 1G）和 CON 组（图 1I）之间存在不同程度的差异。这些结果表明，CSD组微生物群的多样性和组成与CON组有显著差异， CSD组乳酸杆菌的比例显著降低。

2、差异菌群筛选与共现网络构建

基于线性判别分析（LDA），筛选出两组之间的差异属。CSD组乳酸菌明显减少，而加德纳菌、普氏菌等有害菌明显增加（LDA≥2）（图2A）。

基于Spearman相关分析（R  >0.8，P <0.05）构建的属共现网络（图2B ）。由Ralstonia、Sphingomonas和Sediminbacterium组成的共现网络与乳酸杆菌呈显著负相关。这四个属的丰度在两组之间是相反的（图2C-F）。这一结果表明，乳酸菌丰度的下降可能是由微生物群落的干扰和互斥引起的。

3、微生物群的功能富集分析

PICRUSt 2 的结果表征了两组微生物群的活性。作者分别分析了 KEGG 通路的 2 级和 3 级。CSD组在多种代谢过程中表现出显著的活性，除了碳水化合物代谢，这是乳酸产生的重要途径（图3A）。在更精细的途径（3级，图3B）中，CSD组在脂肪酸代谢途径和次生代谢物的生物合成中表现出高活性，而CON组中活跃的碳水化合物代谢途径被精细化为葡萄糖代谢。CON组的磷酸转移酶系统（PTS）和果糖、甘露糖代谢也比CSD组更活跃（图3B）。

4、宫颈环境中的非靶向代谢组学

对来自 60 名受试者的样本同时进行非靶向代谢组学分析。作者获得了 6,130 种代谢物。OPLS-DA 用于区分代谢谱的总体差异，并进一步识别组间的差异代谢物。结果表明，CSD 组内的样本聚集在一起，与 CON 组的整体概况不同（图 4A、B）。确定了两组之间显著差异的 34 种代谢物（图 4C）。CSD 组中两种代谢物显著上调；即N-(3-羟基-二十烷酰基)-高丝氨酸内酯和Ternatin。32种代谢物显著下调，其中两种最显著下调的代谢物是Gingerol和PC(O-10:0/O-8:0)[U]。

5. 宫颈微生物群与代谢组的相关性

为了进一步探索 CSD 中宫颈微生物的致病机制，作者对宫颈微生物组和代谢组进行了综合分析（图 5）。作者发现许多与乳酸菌呈正相关的代谢物与普氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、拉尔斯顿菌属等呈负相关。两种代谢物与乳酸菌呈显著正相关，包括抗肽素C（R  = 0.39）和3-表苦苷酸（R = 0.39)。然而，N-乙酰-a-神经氨酸、N-乙酰-b-神经氨酸、N-(3-羟基-二十烷酰基)-高丝氨酸内酯和Ternatin与与乳酸杆菌互斥的各种属呈负相关。

6. 人类宿主子宫内膜反应

为了进一步了解人类宿主对受干扰的微生物群落的反应，作者对剖宫产瘢痕憩室周围的子宫内膜进行了转录组测序。作者对 33 个与微生物组和代谢组配对的样本进行了转录组分析，其中包括来自 CSD 组的 18 个样本和来自 CON 组的 15 个样本。两组之间共鉴定出982个差异表达基因（图6A），其中176个基因在CSD中上调，806个基因下调（图6B）。作者注意到 CSD 组中上调的基因负调控血管内皮细胞、内皮细胞和上皮细胞的增殖（图 6C）。同时，这些基因在内皮细胞凋亡过程中也很活跃。这表明局部血管生成在 CSD 组中受到阻碍。下调基因主要集中在免疫系统相关过程中（图6D）。

通过构建O2PLS模型实现了微生物与转录组的整合。经过10次交叉验证，最终将模型构建参数设置为n  = 5，nx = 3，ny = 1，R2X为0.91，R2Y为0.90（图7A）。这两个参数表明模型是可靠的。图 7B显示了两个组学的前 15 个加载特征。对两组前30名加载的特征进行了Spearman相关分析，试图找出特定属与基因之间的关系。

作者发现了几个特定基因，包括 DKK1、CXCL14、SCARA5、APOD、S100A4、CFD、GPX3 和 HBB。这些基因与与乳酸杆菌互斥的属显著正相关（图2B ）但与乳酸杆菌负相关（图7C）。这些基因的功能富集分析结果表明，它们主要活跃于细胞连接组装的负调控和上皮间质转化的过程中（图7D）。细胞连接组装是血管生成的重要过程。这一结果表明，CSD形成过程中的血管生成障碍和内膜增生障碍与微生物障碍密切相关。

本研究试图从多个角度解释宫颈微生物群和代谢物对 CSD 女性的影响，包括微生物角度和人类宿主反应角度。作者观察到，CSD组宫颈菌群结构与对照组不同。CSD组乳酸菌明显减少，而潜在有害菌种的比例和丰度增加。乳酸杆菌的优势与阴道健康有关，该属的消耗可导致许多不利条件。在共现网络中，作者发现乳酸杆菌与三种潜在的致病细菌之间存在相互排斥的关系，很可能是CSD 组中乳酸杆菌减少的重要机制。

此外，观察到CSD组显著降低了碳水化合物代谢二级通路和半乳糖代谢三级通路的活性。半乳糖代谢途径是乳酸杆菌产生乳酸的重要途径，这一结果也证实了乳酸杆菌的活性在CSD组中受到抑制。CSD 组微生物群的另一个活跃特征是脂肪酸的活跃代谢。这一结果表明，脂肪酸在 CSD 组中被大量消耗。因此，乳酸菌代谢活性的抑制和潜在致病菌的脂肪酸代谢活跃是CSD组的重要特征，这可能是造成不良生殖能力的重要原因。

为了验证基于序列的微生物活性表征并评估 CSD 和对照组之间宫颈代谢物的差异，在两组中鉴定了 34 种差异代谢物。代谢组学结果再次证实了我们基于微生物组数据发现的共现网络中的互斥关系，即乳酸杆菌的丰度和活性。被显著抑制，多种有益脂肪酸被大量消耗。

进一步作者对 CSD 周围的子宫内膜进行了转录组测序。CSD组显著上调基因的GO富集分析表明，这些基因集中在负调控血管内皮细胞、内皮细胞和上皮细胞增殖的生物学过程中。在整合微生物组和转录组数据后，作者发现调节这些功能的基因是之前数据中鉴定的潜在致病菌，乳酸杆菌与这些不利的生物活性呈负相关。

到目前为止，作者已经揭示了潜在的有害微生物确实对宿主子宫内膜产生了不利影响。这些不良反应的机制包括抑制有益细菌（如乳酸杆菌）的活性，消耗子宫内膜的保护性代谢物，以及产生有害代谢物。

据作者所知，这是第一个详细研究 CSD 中微生物群落紊乱的致病机制的研究。利用微生物群的组成和活性特征，已经开发出开发新的和更有效的益生菌制剂的想法。

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