IF41︱Molecular cancer：浙江大学医学院附属邵逸夫医院研究团队发现m6A与肾细胞癌舒尼替尼耐药新机制

舒尼替尼是一种多靶点酪氨酸激酶受体（RTK）抑制剂，是用于治疗复发和无法切除的肾细胞癌患者的一线治疗靶向药物。然而，大约10%-20%的晚期RCC患者对舒尼替尼表现出原发性耐药，其余大部分患者在治疗6-15个月后可能出现获得性耐药和肿瘤进展。因此，研究肾细胞癌中舒尼替尼耐药的潜在分子机制，指导临床展开针对性的治疗，对于改善肾细胞癌患者的预后至关重要。

2022年5月，浙江大学医学院附属邵逸夫医院李恭会泌尿外科团队独立完成的研究“N6‑methyladenosine‑modified TRAF1 promotes sunitinib resistance by regulating apoptosis and angiogenesis in a METTL14‑dependent manner in renal cell carcinoma”在Molecular cancer（最新IF 41.444）杂志在线发表。该研究揭示了m6A修饰的TRAF1通过以METTL14依赖的方式调控舒尼替尼耐受的肾癌细胞中凋亡和血管生成，促进舒尼替尼耐药。该研究创新性地揭示了肾细胞癌舒尼替尼耐药的新机制，提示靶向TRAF1及其通路可能是治疗临床上舒尼替尼耐受的肾细胞癌患者的一种新的药物干预途径。

1.舒尼替尼耐药RCC细胞系和移植瘤模型中TRAF1表达上调

研究首先通过增加舒尼替尼浓度慢性暴露建立了两株RCC舒尼替尼耐药细胞株（78R和OSR），并利用口服舒尼替尼诱导建立了小鼠耐药移植瘤（CDX-R）模型。耐药细胞和肿瘤均表现出对舒尼替尼治疗的低敏感性。

利用3对细胞样本和3对CDX组织样本进行RNA测序发现交集中的196个差异表达基因（图1A，B），富集分析显示血管生成和凋亡通路可能对舒尼替尼耐药有影响（图1C）。其中，TRAF1的RNA和蛋白水平在耐药细胞和模型中均显著上调（图1D-I）。另外通过收集在邵逸夫医院泌尿外科接受舒尼替尼治疗的肾癌患者的石蜡切片以及病人信息，发现在对舒尼替尼更差响应的临床患者中TRAF1表达更高（图1J，K），高表达TRAF1的患者其整体生存更差（图1L）。这些数据表明TRAF1可能与肾癌舒尼替尼耐药具有相关性。

图1.舒尼替尼耐药RCC患者TRAF1水平升高

2. TRAF1对于促进舒尼替尼耐药至关重要

为了研究TRAF1在舒尼替尼耐药中的功能，作者分别在敏感株和耐药株细胞中过表达或敲低TRAF1水平。结果发现TRAF1敲低可显著降低耐药细胞株中的舒尼替尼耐药，而在过表达的细胞中发现耐药性增加（图2A，B）。一系列细胞表型实验也证实TRAF1在舒尼替尼耐药中的重要作用。

图2.TRAF1在舒尼替尼耐药中起关键作用

小管形成实验发现TRAF1过表达显著增强了血管生成（图3A，B），而TRAF1表达的降低抑制了血管生成（图3C，D）。通过生信分析发现了一些潜在的调控因子可能介导TRAF1驱动的舒尼替尼耐药，部分下游基因如mTOR、VEGFA、RELA（p65）和PARP的表达和TRAF1呈正相关，过表达TRAF1显著激活了AKT/mTOR/HIF1a/VEGFA通路。这些结果表明，TRAF1对维持舒尼替尼耐药性至关重要，沉默TRAF1可通过抑制血管生成和诱导肿瘤细胞凋亡增加舒尼替尼的疗效。

图3.TRAF1在舒尼替尼耐药中起关键作用

3. TRAF1受m6A修饰调控

进一步探讨TRAF1的转录调控在敏感和耐药细胞系之间是否存在差异。通过m6A水平定量发现耐药细胞和模型中整体m6A修饰显著更高（图4A-C）。m6A免疫沉淀qPCR实验显示耐药细胞中TRAF1的m6A修饰水平更高（图4D，E），同时发现m6A甲基转移酶复合物成分METTL14在耐药株中表达更高（图4F）。在舒尼替尼耐药的CDX模型和患者组织中也发现了METTL14表达增加（图4G，H），METTL14和TRAF1的RNA及蛋白水平均显示出正相关（图4I-K）。与之类似，METTL14沉默或者过表达后均显著改变了TRAF1的m6A修饰（图4M，N）。

图4.TRAF1受m6A甲基化修饰调控

4. METTL14依赖m6A-IGF2BP2调控TRAF1的mRNA稳定性

有证据表明m6A修饰可能影响转录本的稳定性，耐药株中TRAF1转录本的半衰期比敏感株更长，而在过表达METTL14后TRAF1转录本的半衰期增加（图5A-C）。作者通过构建TRAF1的突变体进一步研究是否METTL14通过影响其稳定性调控TRAF1，结果发现野生型METTL14而非突变体显著增加了TRAF1 3’UTR报告基因的表达。另外，无论野生型或突变体METTL14均不能影响TRAF1突变体3’UTR的荧光素酶活性（图5D-F）。这些结果表明基于m6A调控的方式影响了TRAF1的稳定性。

为了识别参与调控TRAF1的reader蛋白，作者通过小干扰RNA识别了IGF2BP2显著影响TRAF1的表达（图5G）。RIP检测显示了IGF2BP2和TRAF1 mRNA之间的直接相互作用（图5H）。此外，在舒尼替尼耐药细胞系中，IGF2BP2和TRAF1转录本之间的直接相互作用更强（图5I）。而调控METTL14表达后，相互作用受到显著影响（图5J，K）。抑制IGF2BP2的细胞中，TRAF1 mRNA的稳定性受损（图5L）。这些结果表明，METTL14介导的m6A修饰以IGF2BP2依赖的方式增强了TRAF1 mRNA的稳定性。

图5.METTL14调控TRAF1的mRNA稳定性

5.TRAF1依赖于METTL14维持舒尼替尼耐药，在体靶向TRAF1抑制RCC舒尼替尼耐药

作者通过共同调控METTL14和TRAF1的表达证实了TRAF1通过METTL14依赖性调控凋亡和血管生成通路促进舒尼替尼耐药。并进一步在小鼠体内注射干扰TRAF1的AAV病毒，发现小鼠肿瘤的舒尼替尼耐药性降低，表明靶向TRAF1可能成为舒尼替尼治疗患者的一种新的药物干预手段。

本研究相关成果申请了国家自然科学基金青年项目。浙江大学医学院附属邵逸夫医院的陈元雷医师、陆泽毅博士为共同第一作者，通讯作者为浙江大学医学院附属邵逸夫医院李恭会教授及夏李群副研究员。

图6.TRAF1在舒尼替尼耐药中的调控和作用模型示意图

本文TRAF1 和METTL14 过表达质粒、TRAF1 和METTL14 过表达/干扰慢病毒等产品均有吉凯基因提供，助力高水平的科学研究。

浙江大学附属邵逸夫医院泌尿外科李恭会教授为本位通讯作者，陈元雷医师为第一作者。