看Cell文章怎么开发帕金森抑制剂

2022-08-20 23:39:50, 陈老湿德国赛多利斯集团

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种常见的神经退行性疾病，最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺（dopamine, DA）能诱导神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。典型的症状就是无力、迟缓、僵硬…

等等，陈老湿怎么最近也有这种感觉。。。哦，不对，这是天气太热，各地高温频频闹得。。。

说回正题，为了探究PD的确切病因，美国约翰霍普金斯大学医学院Dawson实验室曾命名了一种新的程序性细胞坏死形式——Parthanatos，又称PARP-1 dependent cell death，是基于DNA损伤，PARP-1激活的细胞坏死。这种细胞死亡广泛地存在于不同的器官不同的疾病中，包括帕金森病、阿尔茨海默症、多发性硬化症、亨廷顿氏舞蹈病等。

图1

近期，Dawson团队又有了重磅发现——抑制PAAN/MIF核酸酶可防止帕金森病的神经退行性，相关《Cell》文章于2022年5月10日在线发表。该研究揭示了病理性α-突触蛋白（α-syn）诱导的神经变性是通过Parthanatos相关凋亡诱导因子（AIF）核酸酶（PAAN）/巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的核酸酶活性发生的。PAAN/MIF的遗传耗竭和缺乏核酸酶活性的突变体可防止散发性PD的α-syn预成纤维（PFF）小鼠模型中多巴胺能神经元的缺失和行为缺陷。通过化合物筛选，研究人员发现了PAANIB-1—— 一种脑渗透性的PAAN/MIF核酸酶抑制剂，可以防止α-syn PFF、AAV-α-syn过表达或MPTP中毒在体内诱发的神经退行性。这项发现可能在人类神经退行性病症中具有广泛的意义。

陈老湿带大家整理下研究思路：

敲除或者耗竭PAAN/MIF核酸酶活性可以减少α-syn PFF引起的病理变化

证明PAAN/MIF核酸酶活性诱导的基因组DNA裂解和神经元死亡

构建筛选平台，通过受体蛋白复合物筛选小分子化合物库

优化小分子结构，并进行药代动力学分析

动物实验评估药物的特性

首先，研究人员通过基因敲除(KO)和突变(E22Q、P2G)，利用腺相关病毒（AAV）在MIF KO小鼠中表达PAAN/MIF WT、PAAN/MIF E22Q和MIF P2G的基因，证实PAAN/MIF的核酸酶活性，而不是MIF的异构酶酶活性，是α-syn PFF诱导的体内神经退行性病变所必需的（图 2）。

图2通过删除PAAN/MIF的核酸酶活性，α-Syn PFF诱导的病理学特征减少

接着，研究人员确定了PAAN/MIF核酸酶转位介导了α-syn PFF诱导的基因组DNA裂解和神经元死亡。AIF和PAAN/MIF在α-syn PFF给药后相互作用，它们在细胞核内共同定位（图3C）。PAAN/MIF WT、E22Q和MIF P2G在对α-syn PFF的反应中的核转位没有差异。敲除PAAN/MIF可以防止α-syn PFF诱导的基因组DNA裂解（图3D）、细胞死亡（图3E和3F）。在MIF KO神经元中，通过慢病毒表达PAAN/MIF WT和MIF P2G可恢复基因组DNA的裂解和细胞死亡，但在用PAAN/MIF E22Q和AIF结合缺陷突变体PAAN/MIF E22A的神经元中未观察到DNA裂解和细胞死亡（图3D-3F）。在PAAN/MIF E22Q和MIF P2G回补的神经元中也得到了类似的结果。这些数据表明，PAAN/MIF的核酸酶活性及其与AIF的结合对基因组DNA的裂解和α-syn PFF诱导的细胞死亡是必需的。

图3PAAN/MIF核酸酶活性是预防α-syn PFF诱导神经毒性的关键

在确认了PAAN/MIF核酸酶活性是诱导α-syn PFF引发病理性变化的关键证据后，研究人员构建了一个基于荧光显色的DNA完整性筛选平台（图4A）。当MIF具有核酸酶活性就可以结合到基因组DNA上，从而破坏DNA双链完整性，导致荧光信号降低或消失。当抑制剂与MIF结合后，MIF不再具备核酸酶活性，因此荧光信号正常显示。通过这一平台的构建，研究人员筛选了具有45,000个候选分子的化合物库。经过多轮筛选，最终找到了编号C8的化合物能防止用人α-syn PFF处理的人皮质神经元的基因组DNA裂解（图4G和4H），并且可以在口服后仍具有穿过血脑屏障（Blood Brain Barrier）的能力。

图4PAAN/MIF核酸酶抑制剂的筛选与鉴定

为了优化C8的效力并增加其中枢神经系统（CNS）的渗透性，研究人员设计了一个C8衍生物，优化后命名为C8-31（以下称为parthanatos-associated nuclease inhibitor-1，PAANIB-1），它与C8的不同之处在于增加了一个氟（图5B）。PAANIB-1能有效地抑制PAAN/MIF核酸酶的活性和Parthanatic细胞的死亡（图5A）。PAANIB-1抑制MNNG诱导的Parthanatic细胞死亡的IC50为0.28 μM，C8的IC50为0.52 μM（图5C）。PAANIB-1与C8相似，通过抑制PAAN/MIF核酸酶的活性，保护神经元免受α-syn PFF引起的突触障碍、NAD+减少和细胞死亡。

图5PAANIB-1是一种PAAN/MIF核酸酶抑制剂

然后，研究人员需要确定PAANIB-1如何影响PAAN/MIF核酸酶，首先就要判断PAANIB-1与PAAN/MIF是否直接结合？

PAAN/MIF与PAANIB-1的结合实验不出意外地选用了Octet® BLI（生物层干涉）分子互作分析系统进行定量检测，结果表明二者的亲和力KD值为1.56 μM（图6A）。

研究人员构建PAAN/MIF三聚体模型，预测了PAAN/MIF的61-64、67-68、73、98-100和106位的氨基酸是潜在的PAANIB-1结合点。对推定结合位点周围的每个残基进行了丙氨酸突变。其中，在PAAN/MIF L62A、PAAN/MIF 61-64A和PAAN/MIF N73A突变体中，PAANIB-1对MNNG诱导的细胞死亡的保护作用明显减弱（图6C）。进一步测定PAAN/MIF WT和丙氨酸突变体与PAANIB-1的结合动力学，结果表明，PAAN/MIF WT和Y100A突变体与PAANIB-1结合，而L62A和N73A突变体的结合明显减弱（图6D）。