【微生物专题】——微生物多样性测序

2022-08-12 02:36:59, 蚂蚁无所谓上海欧易生物医学科技有限公司

在地球各种生境中，微生物表现出极大的多样性。然而由于纯培养法培养微生物的限制性，绝大多数种类的微生物并未得到了解。有数据表明，各种生境中大约只有1%的微生物是可培养的，多达99%的微生物在现有的实验条件和技术下尚未得到纯培养。

从国内外目前采用的方法来看大致包括以下几类：传统的微生物平板纯培养法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等分子生物学方法。而近年来高通量测序技术凭借低成本、高通量、流程自动化的优势为研究微生物群落结构提供了新的技术平台。

微生物多样性测序基于第二代高通量技术对16S rRNA/18S rRNA/ITS等基因序列进行测序，能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测，获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。

哪些研究需求可以做微生物多样性测序

(1) 物种丰度值检测：

检测环境样本中的优势物种
检测环境样本中的稀有物种
检测特定的感兴趣的物种

(2) 不同分组样品相似性比较：

样本间的相似性聚类
不同来源的样本的差异性比较

(3) 寻找不同分组间的重要的Biomaker

统计分析寻找出引起不同分组差异的重要的微生物
寻找潜在的微生物之间的关联性

(4) 其它的可与微生物多样性相关的分析

外部环境的变化必然会带来微生物群落的变化，环境因子会带来哪些菌属的丰度变化，这些菌属（可能是有益菌、有害菌、功能菌）又给环境个体带来怎样的影响，这些均可做微生物多样性的检测。

测序区域选择

核糖体RNA即rRNA，占RNA总量的82%左右。核糖体RNA的编码DNA序列中既有保守区又有可变区，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。

细菌和古菌

原核生物核糖体沉降系数约为70S，由50S和30S两个亚基组成。50S大亚基含有两种RNA分子，相对分子质量大的rRNA的沉降系数为23S，相对分子质量小的rRNA为5S。30S小亚基含有一个16S的rRNA分子。因此原核生物的rRNA分三类：5SrRNA、16S rRNA和23SrRNA。

1977年，Carl Woese就是根据16S rRNA 的系统进化关系图，提出了著名的三域学说，并且提出了古菌这一说法。在 16S rRNA 分子中，不但含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。16S rRNA 的相对分子量大小适中，约1540bp，含有足够多的信息以便于亲缘关系研究；5SrRNA 太短；而23S rRNA 的序列相对于当时的测序技术显得有点过长。

16S rRNA全长

真菌18S 和ITS 区域

真核生物80S核糖体中包含4种沉降系数不同的rRNA，其中，40S核糖体亚基（小亚基）中包含18S rRNA，而60S核糖体亚基（大亚基）中包含5S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA。即真核细胞核糖体中通常含28S、18S、5.8S和5S 四种rRNA；真核细胞中的18S rRNA是16S rRNA的同源RNA，其相对分子质量约为0.7 MDa，长度约为1900 nt。18S rRNA除了比16S rRNA稍长且多一些臂和环结构外，两者空间结构十分相似，在核糖体中起到的作用也基本相同。

内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)位于18S、5.8S及28S之间，由于不需要加入成熟核糖体，因此在进化过程中能够承受更多的变异，其进化速率为18S rDNA的10倍，属于中度保守的区域，其保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显。