【三代测序传】——Sequel背后的三代测序技术

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【三代测序传】——伊始 · 测序技术简介

上一期小编为大家回顾了一下测序技术的发展，今天小编为大家介绍欧易购入的三代测序仪Sequel背后的三代测序技术。

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近年来，以PacBio测序为代表的第三代基因测序技术逐渐兴起。美国太平洋生物科学公司推出的三代测序又称作SMRT测序，即单分子实时测序，该方法基于纳米小孔的单分子读取技术，无需扩增即可快速完成序列读取。三代测序被广泛应用于基因组研究中始于2013年PacBio成功推出商业化的三代测序仪PacBio RS II。经过不断的改良和升级，PacBio公司在2015年10月推出全新升级的三代测序仪PacBio Sequel测序系统，其具有的长读长、高通量、高准确率等特点定将为研究领域带来全新的三代测序体验。得益于测序系统的优化和光学系统的缩减，Sequel系统变得更加灵巧，身体体积和重量仅为原来的1/3，相对于Illumina Hiseq的体积也缩小11%，但是增大了SMRT Cell运作空间，大大提高了数据产出，减少测序成本。

PacBio三代测序技术简介

SMRT测序的全称是Single Molecule, Real-Time Sequencing，即单分子实时测序，是PacBio推出的一项专利技术。顾名思义，SMRT技术核心就是能够实现单个DNA分子的测序，并且实时监控测序结果。

SMRT Cell

SMRT Cell是PacBio测序中用于DNA上样的芯片，样本完成建库后装载到Cell中才能进行上机测序。其概念可类比二代测序中经常提到的“Lane”。一次运行中（即一个Run），我们按照实验需求选择1 ~ 16个Cell进行测序。PacBio RS II系统配套的SMRT Cell数据产量为500 M ~ 1 G（每个SMRT Cell），最新升级的Sequel系统配套的SMRT Cell可产生5 ~ 10 G的数据（每个SMRT Cell），通量大大提升。

ZMW孔

ZMW孔全称是Zero-Mode Waveguides，通常翻译为零模波导孔。Sequel测序仪的测序工作是以SMRT Cell为单位进行的，而每一个SMRT Cell中都含有大量这种圆形纳米小孔，直径为50~ 100 nm。该小孔利用了一种物理效应——零模波导，外径比激发光波长小，当DNA分子进入小孔后，因激发光从孔底发出的光不能穿透小孔进入上方的溶液区，仅被限制在底部一个足以覆盖被检测DNA部分的区域，进而收集该区域的信号，将背景噪音降到最低。PacBio RS II使用的SMRT Cell中，每个含有15万个ZMW孔，而最新的Sequel平台配套的升级版SMRT Cell中，每个含有100万个ZMW孔，进而通量提升7倍。

SMRT测序原理

PacBioSMRT技术其实也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。SMRT测序采用四色荧光标记的dNTP和ZMW孔完成对单个DNA分子的测序：当DNA模版被DNA聚合酶捕获后，4种不同荧光标记的dNTP通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间。因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。

4色荧光标记4种碱基（即dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。每个ZMW孔中，单个DNA分子模板与引物结合，然后与DNA聚合酶结合，被固定到ZMW孔底部。加入四色荧光标记的dNTP后，DNA合成开始。受碱基配对原则支配，连接上的dNTP会在ZMW孔底部停留较长时间，激发后所发出的对应荧光信号被识别，返回的荧光信号会形成一个特殊的脉冲波。另一方面由于荧光信号连接在dNTP的磷酸基团上，当上一个dNTP合成后，磷酸基团自动脱落，保证了检测的连续性，提高了检测速度，并配合高分辨率的光学检测系统以实现实时检测。

SMRT测序中使用的这个DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。另一个关键是荧光基团标记在核苷酸3’端磷酸上。在DNA合成过程中，3’端的磷酸键随着DNA链的延伸被断开，标记物被弃去，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。而第二代测序技术中荧光基团都标记在5’端甲基上，在合成过程中，荧光标记物保留在DNA链上，随DNA链的延伸会产生三维空间阻力，导致DNA链延长到一定程度后出现错读，这是限制二代测序读长的原因之一。SMRT测序最大限度地保持了聚合酶的活性，是最接近天然状态的聚合酶反应体系。

PacBio SMRT技术的一个关键是怎样将反应信号与周围游离碱基的强荧光背景区别出来。他们利用的是ZMW（零模波导孔）原理：如同微波炉壁上可看到的很多密集小孔，小孔直径有考究，如果直径大于微波波长，能量就会在衍射效应的作用下穿透面板而泄露出来，从而与周围小孔相互干扰。如果孔径小于波长，能量不会辐射到周围，而是保持直线状态（光衍射的原理），从而可起保护作用。同理，在一个反应管（SMRT Cell，单分子实时反应孔）中有许多这样的圆形纳米小孔，即ZMW，外径100多纳米，比检测激光波长小（数百纳米），激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围内（体积20×10^-21L），正好足够覆盖需要检测的部分，使得信号仅来自这个小反应区域，孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景降到最低。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。三代测序同样存在测序错误，但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。目前Sequel系统已能达到相当于Q50以上质量的测序准确度。

（本专题每周奉上，欢迎关注。）

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