J Hematol Oncol：上交大揭示肿瘤相关巨噬细胞 LncRNA-PACERR 促进PDAC恶性进展新机制

近日，上海交通大学医学院附属瑞金医院沈柏用教授团队在国际血液病与肿瘤疾病顶级期刊《Journal of Hematology and Oncology》（影响因子23.168，中科院1区）在线发表了发表题为“LncRNA-PACERR induces pro-tumour macrophages via interacting with miR-671-3p and m6A-reader IGF2BP2 in pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究论文。该论文揭示了肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中长链非编码RNA-LncRNA-PACERR在TAMs中高表达，同时通过ceRNAs作用模式和与m6A reader IGF2BP2相互结合激活KLF12/AKT/c-myc信号通路促进胰腺癌恶性进展的内在分子机制。这一发现有望为胰腺癌的新免疫靶向治疗提供理论基础。

1. LncRNA-PACERR在TAMs中过量表达，PACERR⁺TAMs的浸润升高与PDAC患者的预不良预后相关。

为了确定LncRNA-PACERR在PDAC的TAMs中的表达水平，作者利用磁激活细胞分选技术（MACS）从46名PDAC患者的肿瘤核心中分离出CD163+细胞，代表TAMs，以及CD80+细胞，被视为正常组织驻留巨噬细胞（M1-NTRMs），体积为0.5cm³。同时，我们用免疫组化法呈现了CD163和CD80的表达，并证实CD163⁺TAMs高浸润的PDAC患者的预后较差。我们通过流式细胞仪分析确保了分选细胞的高纯度。对PDAC中46个配对的TAMs和M1-NTRMs进行qPCR分析，并对PDAC组织芯片（TMAs）进行FISH-免疫荧光分析，该芯片由110名PDAC患者的肿瘤组织和非肿瘤组织组成，证明LncRNA-PACERR在TAMs中的表达明显比M1-NTRMs高。并且CD163和LncRNA-PACERR之间有强烈的共定位关系。为了进一步检查LncRNA-PACERR⁺TAMs的临床预后价值，我们统计了TMAs中LncRNA-PACERR的阳性率，并根据阳性率的中位数将110名胰腺癌患者分为PACERR高表达组和PACERR低表达组。Kaplan-Meier分析显示，LncRNA-PACERR⁺-TAMs的高浸润与PDAC的预后不良有关（P<0.01）。总的来说，这些结果显示，更多的LncRNA-PACERR⁺TAMs与PDAC的预后较差有关。

2. LncRNA-PACERR⁺TAMs的特点是M2极化巨噬细胞，在体外和体内促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了明确PACERR的功能，作者使用THP-1细胞系和PATU-8988/PANC-1细胞在体外构建TAMs共培养模型。qPCR、流式细胞术等实验分析证实，LncRNA-PACERR促进M2型巨噬细胞的极化。由于以往许多研究报道TAMs促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，作者通过胰腺癌细胞和巨噬细胞的体外共培养模型，探讨了TAMs的促瘤功能。首先，作者通过克隆形成实验和CCK8增殖实验验证了LncRNA-PACERR对胰腺癌细胞增殖的作用，通过Transwell试验验证了其对胰腺癌细胞的迁移和侵袭的影响。为了进一步验证LncRNA-PACERR在TAMs中的影响，作者通过构建小鼠皮下瘤模型和肝转移模型发现与体外相一致的想象。

3. LncRNA-PACERR通过海绵化miR-671-3p上调KLF12/p-AKT/c-myc轴

为了揭示LncRNA-PACERR在促进恶性肿瘤进展中发挥功能的分子机制，作者确定了LncRNA-PACERR的亚细胞位置， LncRNA-PACERR主要分布在TAMs的细胞质和细胞核中。作者验证了在THP-1衍生的TAMs中，LncRNA-PACERR被敲除后，MiR-671-3p被上调，而miR-4448则没有变化。此外，RIP结果显示，AGO2与LncRNA-PACERR和miR-671-3p都有明显结合。通过RNA-pull down和双荧光素酶报告实验确定miR-671-3p与LncRNA-PACERR的相互作用。随后，作者从在线预测网站中参考了miR-671-3p的两个潜在靶基因，最后确定了最有名的靶基因-KLF12。据报道，KLF12通过AKT/c-myc途径促进恶性肿瘤的进展。正如预期的那样，Western Blot分析显示，在THP-1衍生的TAMs中，由LncRNA-PACERR调控的KLF12明显促进了AKT的磷酸化，通过PTEN的下调增加了c-myc的表达。LncRNA-PACERR可以通过封闭miR-671-3p来释放KLF12，从而实现TAMs通过KLF12/AKT/c-myc途径促进胰腺癌的恶性进展。

4.KLF12/LncRNA-PACERR复合物招募EP300以促进LncRNA-PACERR在细胞核中的转录。

作者根据之前推测，KLF12可能促进LncRNA-PACERR在细胞核中的转录。我们通过ChIP和Luciferase等实验检测确定KLF12与TAMs中LncRNA-PACERR的启动子区域结合。鉴于大多数转录因子通过影响组蛋白修饰来调节基因转录，我们用ChIP实验来确定KLF12增加了LncRNA-PACERR在TSS上的H3K27ac的富集程度。因此考虑KLF12是否会招募经典的组蛋白乙酰转移酶-EP300。这一猜想通过co-IP检测得到了验证。通过之前报道，作者假设KLF12会与细胞核中的LncRNA-PACERR结合。我们接下来进行了RNA下拉和RIP实验，验证了这种相互作用。数据表明，LncRNA-PACERR也被KLF12直接转录调节。

5.LncRNA-PACERR通过与TAMs中的IGF2BP2合作而发挥致癌作用

由于以前有报道说lncRNA可以通过与特定的蛋白质结合而在细胞质中发挥作用，作者进行了RNA pull down和质谱分析，筛选出与LncRNA-PACERR相互作用的m6A相关蛋白-IGF2BP2。进一步验证了IGF2BP2是LncRNA-PACERR的RNA结合蛋白。此外通过LncRNA-PACERR FISH和IGF2BP2在THP-1驱动的TAMs中的共定位分析支持它们的相互作用。作者通过qPCR、Western blot、FISH和IF检测发现，LncRNA-PACERR和IGF2BP2并不改变对方的表达水平。这些结果表明LncRNA-PACERR与IGF2BP2有物理结合作用。

6. LncRNA-PACERR通过与IGF2BP2合作增加KLF12和c-myc的mRNA稳定性

许多研究报道，IGF2BP2作为一个m6A阅读者，可以稳定大量的mRNA转录物，包括c-myc和许多转录因子。同时，由于KLF12和c-myc是LncRNA-PACERR的下游目标，作者非常好奇LncRNA-PACERR是否与IGF2BP2合作来调节KLF12和c-myc的稳定性。为了证实这一假设，作者使用qPCR和Western blot分析来阐明LncRNA-PACERR/IGF2BP2对KLF12和c-myc表达的积极调节作用。并用放线菌素D发现IGF2BP2敲除后，LncRNA-PACERR过量表达的KLF12和c-myc的稳定度增加，而LncRNA-PACERR敲除后，IGF2BP2过量表达的KLF12和c-myc的半衰期被取消。作者通过一系列实验数据表明，LncRNA-PACERR与IGF2BP2合作，增强KLF12和c-myc在TAMs中的稳定性。

本研究中LncRNA-PACERR shRNA慢病毒、KLF12-Flag和KLF12-Mut-Flag 过表达质粒均由吉凯基因提供。

上海交通大学医学院附属瑞金医院胰腺外科刘逸豪博士，上海交通大学医学院胰腺癌疾病研究所施敏敏技术员和何兴烽硕士为本文共同第一作者。上海交通大学医学院附属瑞金医院胰腺外科沈柏用教授、王建承教授和南开大学孙宝发教授为本论文共同通讯作者。