项目文章| 安徽医科大学梁朝朝团队运用16S+代谢组学揭示肠道菌群对自身免疫性前列腺炎的调节机制

2022-07-30 11:28:10, 多层组学定制服务 上海欧易生物医学科技有限公司


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前言


前列腺炎是一种泌尿生殖系统疾病(CP/CPPS),是最常见的前列腺炎类型,约占前列腺炎人群的90%-95%。CP/CPPS以盆腔长期慢性疼痛伴或不伴低尿路症状为特征,已成为全球公认的男性健康威胁。近年来越来越多的证据表明免疫失衡在发病机制中发挥了重要作用。因此,CP/CPPS也被认为是一种器官特异性的自身免疫性疾病。T淋巴细胞,特别是CD4+T细胞,被发现是CP/CPPS发病机制的主要贡献者,Th17细胞是CD4+T细胞的一个子集,据报道,Th17细胞与多种自身免疫性疾病的发生密切相关。


2022年7月,安徽医科大学第一附属医院泌尿外科梁朝朝教授课题组在《Frontiers in Immunology》(IF:8.796)期刊发表了题为“Gut Microflora Modulates Th17/Treg Cell Differentiation in Experimental Autoimmune Prostatitis via the Short-Chain Fatty Acid Propionate”的研究成果,本研究运用粪便16s rRNA测序和非靶向/靶向代谢组学等研究方法分析了EAP小鼠肠道微生物组和代谢产物,以研究EAP中肠道微生物群和相关代谢物的丰度是否发生改变,从而发现肠道菌群通过其代谢物对EAP小鼠模型中免疫反应调节的影响。


杜和喜、岳少宇、牛迪为第一作者,梁朝朝、张力、陈先国、李春为共同通讯作者,欧易/鹿明生物提供该项目粪便16s rRNA测序和非靶向/靶向代谢组学相关工作。



研究背景


肠道菌群系在调节宿主的免疫/炎症反应中发挥着不可或缺的作用。一般来说,肠道菌群的系统功能主要归因于微生物代谢组,特别是短链脂肪酸(SCFAs),这是膳食纤维发酵最具特征的最终产物。一方面,这些细菌来源的SCFAs可以进入循环,调节肠外器官中的免疫系统,包括Th17和Treg细胞。另一方面,SCFAs已被证明可以促进肠道中的免疫细胞进入循环和远端组织。因此,SCFA代谢与免疫紊乱之间的关系已被证实和接受。目前尚不清楚肠道微生物驱动的SCFAs是否对前列腺炎有影响。


研究思路



实验方法


研究材料:小鼠

研究流程:

1.EAP的小鼠模型建立

2.组织病理学和免疫组化

3.流式细胞仪

4.CD4+T细胞的分离和体外分化

5.慢病毒感染

6.酶联免疫吸附测定

7.DNA提取和16s rRNA测序

8.粪便非靶向/靶向代谢组学

9.SCFAs测量分析

10.丙酸SCFA治疗分析

11.蛋白印迹分析

12.实时聚合酶链式反应

13.粪便微生物群移植


研究结果


1.Th17和Treg细胞比例及EAP相对细胞因子水平显著异常

在本研究中,作者首先通过两次皮下免疫建立了EAP小鼠模型(图1A)。EAP模型通过组织学检查和盆腔疼痛测量结果进行评估。如图1B-D所示,与对照组相比,EAP组的前列腺炎症和对触觉异常痛的反应频率均明显增加,说明小鼠EAP模型建立成功。接下来,作者分析了对照组和EAP小鼠脾脏淋巴细胞中Th17和Treg细胞的百分比。最后,作者对两组前列腺切片进行IL-17A和FoxP3进行免疫组化染色。结果显示,EAP小鼠前列腺组织中il-17a阳性染色细胞比例增加,foxp3阳性染色细胞比例降低(图1M、N)


图1 | 评价EAP模型、Th17/Treg细胞比例及相关炎症细胞因子水平


2.EAP中粪便代谢组的改变

肠道菌群在免疫稳态中起着关键作用,通常通过其代谢物调节宿主的免疫系统。因此,作者运用代谢组学分析来研究EAP小鼠的肠道代谢谱。通过对粪便进行GC-MS非靶向代谢组学分析 ,发现对照组和EAP小鼠之间共有94种代谢物的丰度差异(图2A,B)。我们进一步对对照组和EAP组之间的差异表达通路进行了KEGG通路富集分析(图2C)


图2 | 对照组和EAP小鼠的代谢组学谱


3.EAP的肠道菌群与对照组有显著差异

EAP小鼠的脂肪多样性指数、香农指数、辛普森指数、观察物种指数和PD_whole_tree均显著低于对照组,表明肠道微生物群的a-多样性发生了显著改变(图3A)。PCoA分析是生物多样性的一个指标,结果显示对照组和EAP小鼠样本之间存在明显的分离,表明两组之间的微生物群组成存在显著差异(图3B)。在门水平上,EAP小鼠的厚壁菌门的相对丰度较少,硝化螺旋体、芽胞菌和梭菌门。相反,作者在EAP组中检测到拟杆菌门、蓝藻菌门和白腹杆菌门的增加(图3C)。在属水平上,EAP中乳酸菌明显增加,而其他9个菌群明显减少(图3D)


图3 | 对照组和EAP小鼠肠道微生物群的比较


4.EAP中丙酸显著降低

通过靶向代谢组学测定六种最丰富的短链脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和异丁酸)在粪便和血清中的浓度。发现对照组小鼠粪便中丙酸的浓度高于EAP组,其他SCFAs均无差异(图4A)。对EAP小鼠血清中SCFA浓度的分析也显示丙酸含量显著下降(图4B)


图4 | 对照组和EAP小鼠中SCFAs的绝对浓度


5.补充丙酸可改善EAP,恢复体内Th17/Treg失衡

根据饮用水中是否加入丙酸,将EAP小鼠分为未处理组(EAP组)和丙酸处理组(EAP+PA组)(图5A)。值得注意的是,补充外源性丙酸显著降低了EAP小鼠的前列腺炎症和盆腔疼痛(图5B-D)。此外,丙酸处理抑制了EAP小鼠脾脏淋巴细胞中Th17细胞的分化(图5E-H),但有利于Treg细胞的分化(图5I,J)。此外,口服补充丙酸可降低了EAP小鼠血清中IL-17和GM-CSF的产生,而增加了TGF-b和IL-10的分泌(图5K)。在前列腺组织中观察到与IL-17、TGF-b和IL-10水平相似的结果(图5L)


图5 | 丙酸可改善EAP,恢复体内Th17/Treg失衡


6.丙酸在体外调控Th17/Treg细胞的分化

作者通过体外实验进一步评估了丙酸对EAP的影响。用丙酸分离出在Th17/Treg分化条件下的CD4+幼稚T细胞(图6A,D)。与预期的一样,丙酸可以抑制更多的CD4+幼稚T细胞分化为Th17细胞(图6B),而它也与促进向Treg细胞的分化有关(图6E)


图6| 丙酸在体外调控Th17/Treg细胞的分化


7.丙酸通过调节GPR43-HDAC6轴来调节Th17/Treg细胞的分化

为了探讨丙酸是否以GPR依赖的方式调控Th17和Treg细胞的分化,作者检测了GPR43的表达,这是在免疫和代谢中发挥重要作用的GPRs之一,以及细胞内信号传导HDAC6(31)。首先,在Th17和Treg细胞条件下,丙酸刺激下GPR43的表达增加,而使用LV-shGPR43则抑制了GPR43的表达(图7A)。作者还观察到,当分离的CD4+T细胞用丙酸处理,并在Th17/Treg分化条件下孵育时,HDAC6的表达水平降低。然而,在LV-shGPR43感染后,它显著增加(图7B)。另外,抑制GPR43有助于Th17细胞分化的急剧增加(图7C,D),而Treg细胞的分化明显减少(图7E,F)。前列腺组织的免疫组化检测显示,在LV-shGPR43处理的EAP小鼠中,GPR43阳性细胞减少,HDAC6的表达水平增加(图7G,H)


图7 | 丙酸通过调节GPR43-HDAC6轴来调节Th17/Treg细胞的分化


8.EAP粪便移植可诱导受体Treg细胞频率的降低

为了进一步确定肠道微生物群的改变是否导致了EAP中Th17/Treg的失衡,作者运用粪便移植实验,将对照组或EAP小鼠的粪便悬液灌胃到抗生素处理的伪无菌受体小鼠中(图8A)。图8B-E中,与对照组小鼠的粪便移植相比,EAP小鼠的粪便移植中Treg细胞的比例明显降低(p0.05)。因此,将肠道微生物从EAP供体口服转移到健康受体中,导致其Treg细胞频率的降低。


图8 | EAP小鼠粪便移植诱导受体小鼠Treg细胞频率降低


研究讨论


1.EAP中Th17/Treg处于不平衡状态。

2.对照组和EAP小鼠的肠道微生物衍生代谢物存在显著差异,为研究微生物衍生代谢物中脂肪酸在EAP中的作用提供了线索。

3.在EAP中,微生物源性的丙酸显著降低。

4.丙酸有助于改善前列腺炎症,恢复EAP诱导的Th17/Treg失衡。

5.丙酸有助于在体外调节Th17/Treg平衡,进一步加强丙酸在EAP中的免疫调节作用



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本研究为了揭示肠道菌群是否影响CP/CPPS,及其背后的潜在机制,通过皮下免疫建立了一个实验性自身免疫性前列腺炎(EAP)小鼠模型,运用粪便16srRNA测序和非靶向/靶向代谢组学,探索肠道菌群在免疫稳态和自身免疫性疾病的发展中的作用机制,为在饮食干预中补充微生物终产物来改善CP/CPPS患者的免疫障碍提供了一个新的视角。

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END

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