项目文章 | NC：扬州大学李碧春/陈国宏团队证明了从鸡体细胞克隆后代的可行性

近日，扬州大学李碧春、陈国宏教授为共同通讯作者，在 Nature Communications (IF: 12.121) 期刊发表了题为“Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells”的研究论文，阐述了将鸡高度分化的成纤维细胞逆转为生殖干细胞以繁殖后代的理论和方法体系。

扬州大学硕士研究生赵瑞丰、袁霞、靳锴和青年教师左其生博士为并列第一作者，文章中基因组重测序、转录组测序实验和分析由欧易生物协助完成。

自 1997 年“多莉”克隆羊问世以来，已经有 20 多种哺乳动物相继实现了体细胞克隆无性繁殖。然而，禽类动物特殊的卵生模式导致了成熟的体细胞核转移方法无法应用。

鸡原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）的异体移植被证明可以产生后代，并可用于禽类的克隆方法。但目前的 PGCs 移植方法需要大量的 PGCs 细胞，发育 4.5 天的鸡性腺中无法收获满足要求的细胞数量。与之相比，体细胞（如鸡胚成纤维细胞，chicken embryo fibroblasts, CEFs）容易大量获得并可以在体外快速增殖。

已有在哺乳动物中体细胞诱导生成 PGC 的研究，但目前禽类中尚无报道。因此，迫切需要开发一种有效的体外诱导 PGC 的方法来解决禽类克隆的局限性。

本研究将黑羽狼山鸡 CEFs 逆转成 PGCs 并异种移植到隐性白羽白洛克受体鸡（代孕鸡）体内，产出了来源于供体黑羽狼山鸡的后代。研究表明，过表达 Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A (OSNL) 可以将 CEFs 重编程为诱导性多能干细胞 (iPSCs)，并通过 BMP4/BMP8b/EGF 进一步诱导分化为 PGCs。DNA 去甲基化、组蛋白乙酰化和糖酵解激活提高了 iPSC 的诱导效率，而组蛋白乙酰化和糖酵解抑制促进了 PGCs 的形成。将诱导的 PGC (iPGCs) 移植到受体中，受体自交可以产生具有供体特征的 189/509 体细胞来源鸡。微卫星分析和基因组测序证实了后代具有供体的遗传信息。因此，本研究证明了从体细胞克隆禽类的可行性。

1. CEFs 可以重编程为 iPSCs

从黑羽狼山鸡中分离 CEFs 并转染 Oct4/Sox2/Nanog/Lin28A (OSNL)，连续进行 21 天形态学观察。第 15 天细胞出现典型的 iPSCs 形态（图 b），同时伴随 Oct4、Sox2、Nanog 表达量的逐渐上升（图 c）。

图 1 | CEFs 可以重编程为 iPSCs

已有研究表明，表观修饰的变化可以影响哺乳动物的 iPSC 的形成。结果显示，CEFs 去分化重编程过程中，Oct4、Sox2、Nanog 基因启动子区域发生了逐步去甲基化（图 a），而组蛋白乙酰转移酶的浓度逐步上升（图 b）。

在 OSNL 诱导 CEFs 重编程过程中，添加 VC（DNA 甲基化抑制剂）和/或 VPA（组蛋白去乙酰化酶抑制剂），都可以显著提高 iPSCs 克隆的数量（图 c-e），并可以进一步提高 Oct4、Sox2、Nanog 表达量（图 f-g）。以上结果表明，DNA 去甲基化和组蛋白高乙酰化有助于 iPSC 的形成。

图 2 | 鸡 iPSC 生成中 CEF 重编程系统的优化

同时有文章报道，能量供应可以促进体细胞的重编程。在 OSNL 诱导 CEFs 重编程过程中，添加糖酵解激活剂 2i，可以显著提高 iPSCs 克隆的数量（图 a-b）；而添加糖酵解抑制剂 VK3，会降低 iPSCs 克隆数量（图 a-b）。RT-PCR 显示，VK3 可以抑制 ESC 细胞中 Oct4、Sox2、Nanog 表达量（图 c），而 2i 可以促进 CEF 细胞中 Oct4、Sox2、Nanog 表达量（图 d）。以上表明糖酵解可以通过激活内源性多能基因的表达来促进 iPSC 的形成。

图 3 | 糖酵解激活促进鸡 iPSC 的形成

2. iPSC 表现出 ESC 样特征

对 iPSCs 和胚胎干细胞（ESCs）分别进行转录组测序。PCA 和样品相关性分析结果显示，上述 iPSC + VC/VPA 组、iPSC + 2i 组和 ESCs 具有颇为相似的基因表达模式（图 b-c）。

对 iPSCs vs CEFs 之间差异表达基因进行 GO 和 KEGG 富集分析，结果显示差异基因主要富集于干细胞发育相关功能。同时 iPSCs 具有和 ESCs 类似的 ESC marker 基因的表达模式，而与 CEFs 表达模式不同（图 d-e）。

以上结果表明，不同诱导系统诱导的 iPSCs 都表现出与胚胎干细胞相似的基因表达特征。 

图 4 | iPSC 表现出 ESC 样特征

3. 诱导 iPSCs 向 iPGCs 分化

进一步研究 iPSCs 向 iPGCs 的分化过程。实验证实，DNA 去甲基化抑制 iPGC 的形成，而组蛋白高乙酰化和糖酵解抑制可以促进 iPGC 的形成。转录组测序结果分析显示，采用 BMP4/BMP8b/EGF 诱导的 ESCs 表现出与 PGCs 颇为类似的基因表达谱。因此，本研究尝试利用 BMP4/BMP8b/EGF 诱导 iPSCs 向 iPGCs 分化。

结果显示，iPSCs 经 BMP4/BMP8b/EGF 诱导后，细胞在第 2 天开始聚集并在 4-6 天形成胚状体样结构（图 a）。生殖细胞特异性的 CVH 蛋白表达升高（图 b）。CVH 阳性的细胞比例上升（图 d），并且细胞比例受到 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化、糖酵解的影响（图 e）。并且 RT-PCR 证实，在诱导后的细胞中 PGC marker 基因表达水平上升。

转录组测序结果显示，iPSCs 经诱导产生的 iPGCs 与 PGCs 存在相似的基因表达谱（图 g-j）。

分离上述经诱导产生的 iPGCs 并用 pKH26 标记后移植到孵育 2.5 天的鸡胚中，荧光示踪显示 iPGCs 可以迁移到鸡的生殖嵴，表明 iPGC 具有和 PGC 相似的体内活性。

图 5 | 诱导 iPSCs 向 iPGCs 分化

4. 异体移植 iPGCs 以生产具有活力的后代

将来自黑羽狼山鸡（供体鸡） CEFs 诱导产生的 iPGCs 移植到白羽白洛克受体鸡（代孕鸡）胚胎内，孵化后进行自交，509 只后代中有 189 只具有供体鸡的表型特征（图 a-b），并通过微卫星标记证实确实具有供体鸡特异性分子标记。

同时对后代进行基因组重测序，个体聚类树和遗传相似性指标分析都表明，这些阳性后代同时具有供体鸡和受体鸡的基因组特征（图 d-f），表明体细胞克隆的成功。

图 6 | MdTRB1 和 MdJAZ 互作

比较有意思的是，除了有类似供体的黑色羽毛后代，还产生了黑-白羽毛、黄色羽毛、黑-黄羽毛的嵌合体后代，并且其中很多个体像是双胞胎或多胞胎（上图 b）。对控制羽毛颜色的基因 MC1R、TYR 进行 sanger 测序，结果显示在这 2 个基因的启动子和外显子区域均存在突变。对基因组重测序数据分析，筛选到 15 个羽毛颜色相关基因中特异性的 SNPs，在不同羽毛颜色表型中存在特异性组合（上图 g），来自 CEFs 具有相同羽毛颜色表型的后代具有相似的变异类型。

综上，本研究在禽类中建立了一个有效的 CEF-iPSC-iPGC 诱导系统，诱导产生的 iPGCs 可以迁移至生殖嵴，发育成有功能的生殖细胞，以生产后代。本研究突破了禽类动物不能克隆的“瓶颈”，为禽类动物的保种和扩繁，特别是濒危禽类种质资源保护和复原提供了强有力的技术支撑。

Zhao R, Zuo Q, Yuan X, et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nat Commun 2021; 12(1): 2989. (IF: 12.121).

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郑小辫儿  撰文

本文系欧易生物原创

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