2022-07-13 18:51:59, Zissy 上海吉凯基因医学科技股份有限公司
骨关节炎 (osteoarthritis,OA) 是一种严重影响患者生活质量的关节退行性疾病, OA可导致关节疼痛、畸形与活动功能障碍,进而增加心血管事件的发生率及全因死亡率,给患者、家庭和社会造成巨大的经济负担。在骨及关节炎的临床研究中,AAV也是一种十分合适的工具病毒载体,用于相关的基因操作。
(一)注射方式
关节常见的注射方式包括尾静脉注射和关节腔原位注射,尾静脉注射不具备特异性,可以感染全身大多数器官,关节腔内原位注射,可特异性感染关节组织,以风湿性关节炎为例:rAAV通过关节内注射注入风湿性炎关节部位,可成功转导滑膜组织中的细胞(包括成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞),并在该部位产生治疗蛋白[1]。
目前文献中常见的关节炎模型主要通过手术进行造模诱导关节炎,具体方法及检测指标如下:
造模方式
实验方法
检测指标
关节内手术途径诱发骨关节炎
Hulth法,ALCT法(前交叉韧带横断),MMT法(内侧半月板切除法)等
膝关节三维图像观察评分
HE染色
番红固绿染色
免疫组化(IHC)
免疫荧光(IF)
关节内注射药物诱发骨关节炎
木瓜蛋白酶法、胶原诱导型关节炎模型(CIA)、碘乙酸盐
自发型骨关节炎模型
天然自发;基因敲除
关节制动(固定)模型
将关节长时间固定在某一位置,引起关节软骨的破坏,从而形成骨性关节炎(OA)
内侧半月板失稳术诱发c57BL/6小鼠骨关节炎的操作图[2]:
A:切开皮肤;
B:沿着髌韧带(红色箭头示)切开关节囊;
C:暴露内侧半月板,离断内侧半月板胫骨韧带;
D:将髌韧带后脱位充分显露小鼠关节腔解剖结构。
小鼠关节腔微量注射的操作图[2]:
A、C:斜后上方进针,注射生理盐水/甲苯胺蓝后压迫2 min,针眼无液体渗出;
B、D:处死小鼠后切断前后交叉韧带,充分暴露关节面。红色箭头示髌韧带,黑色箭头示胫骨上段,橙色箭头示股骨髁。
(二)AAV在关节炎模型中的应用案例
吉凯客户文献:用HPIP shRNA装载在AAV载体上进行基因转移治疗小鼠关节炎,AAV-HPIP shRNA可减轻OA的组织学症状[3]Hematopoietic PBX-interacting protein mediates cartilage degeneration during the pathogenesis of osteoarthritis。(IF= 17.694)
(h)OA方案用携带HPIP shRNA的腺相关病毒(AAV)治疗小鼠
(i)小鼠整个胫骨的番红O/固绿染色,两周手术后,C57/BL6J小鼠(8周龄)关节内注射携带HPIP shRNA的AAV,6周后进行分析
(j)The显示了小鼠的OARSI等级(n=10) Cs:对照shRNA;Hs:HPIP shRNA
(k)μCT矢状面图和膝关节三维图像。进行软骨表面积的定量分析(n=10)
在C57/BL6J小鼠(8周龄)(n=10)中关节内注射携带HPIP shRNA的AAV:
(a)用指示抗体进行免疫组织化学分析
(b)HPIP的免疫印迹分析
(c)qRT-PCR检测
C57/BL6J小鼠(8周龄)(n=10)的胫骨近端关节内注射携带HPIP shRNA 的AAV:
(d-g)用于ACLT后8周的小鼠手术) 软骨下骨定量分析,包括:总组织体积(TV)(d)小梁模式因子(Tb.Pf)(e),透明软骨厚度(HC-Tn.)(f) 钙化层厚度软骨(CC Tn.)(g)
(h,i)免疫组织化学在8周的小鼠中用指示抗体(h)和qRT PCR检测(i)
(j)ACLT后8周小鼠qRT-PCR检测:IL-1β、TNF-α、MMP-13和ADAMTS5
(三)组织特异性启动子——COL2A1软骨细胞特异性启动子
吉凯客户文献:Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis[J]. Bone Research.( IF=13.567)
实验方法:小鼠AAV感染成骨细胞通过关节软骨中的腺相关病毒 (AAV) 过表达Runt相关转录因子1 (Runx1),并通过减缓早期骨关节炎中软骨中骨关节炎的破坏和减轻晚期骨关节炎中生长板软骨的病理进展来确定其保护作用[4]。
实验结果:软骨细胞特异性 Runx1 敲除 (Runx1f/fCol2a1-Cre) 通过加速早期骨关节炎中蛋白多糖和胶原蛋白 II 的丢失来加剧软骨破坏。此外,该研究观察到生长板变薄和骨化,软骨细胞增殖能力下降,晚期骨关节炎生长板周围骨基质丢失。
吉凯助力
——Runt 相关转录因子 1 (Runx1)过表达AAV
动物选择:8周龄Runx1-knockout mice
启动子选择:COL2A1软骨细胞特异性启动子
注射方式:关节内注射
攻毒剂量:1×1011v.g.per mL(5μL per joint)
检测时间:病毒注射后12周、24周
【参考文献】
[1]Adriaansen J , Vervoordeldonk M , Tak P P . Gene therapy as a therapeutic approach for the treatment of rheumatoid arthritis: innovative vectors and therapeutic genes[J]. Rheumatology, 2006(6):656-668.
[2]冯萌, 钱庄, 李萌,等. 内侧半月板失稳诱发C57BL/6小鼠骨关节炎模型中关节腔微量注射方法的建立[J]. 西安交通大学学报:医学版, 2018, 39(3):5.
[3] DOI: 10.1038/s41467-018-08277-5
[4] DOI:10.1038/s41413-021-00173-x
1.实验技术干货
2.蛋白质组学研究
3.腺病毒简介及应用
4.临床基础研究思路解析
5.组织特异性腺相关病毒
6.单细胞测序
7.慢病毒实验操作指南
8.悬浮细胞专用病毒
9.靶点设计/数据库教程
10.测序技术研究与应用
11.非编码RNA研究技术与应用
12.腺相关病毒选择/应用
13.表观遗传研究
14.文章解析
15.国自然课题设计思路解析
16.生物信息分析及工具
17.外泌体研究
18.肿瘤免疫研究
19.高分文章
20.吉凯病毒神经方向应用案例
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