IF=34.91∣重庆医科大学附属第二医院/陆军特色医学中心联合发现线粒体活化Drp1引起脑缺血再灌注损伤恶性循环的机制

2022年5月27日重庆医科大学附属第二医院麻醉科段晨阳-黄河教授团队与陆军特色医学中心李涛教授团队合作在国际期刊Military Medical Research（IF=34.91）上发表了题为《Activated Drp1 regulates p62-mediated  autophagic flux and aggravates inflammation  in cerebral ischemia-reperfusion via the ROS-RIP1/RIP3-exosome axis》的文章。本文发现：脑缺血再灌注后，线粒体活化Drp1一方面会加速p62介导的自噬小体的形成，另一方面通过RIP1/RIP3通路阻止自噬小体向自噬溶酶体的转变，而未降解的自噬小体会以外泌体/微囊泡的形式分泌出细胞外引发炎症级联反应，会进一步损伤细胞线粒体导致ROS堆积加重和自噬小体降解受阻，形成恶性循环。

脑是对缺血缺氧最敏感的器官，缺血性脑血管病的死亡率在人类疾病中居第二位。尽管目前对缺血性脑血管病的治疗常采用机械取栓、静脉输注纤溶酶原激活剂等措施来恢复缺血脑组织的血液供应，但再灌注后对脑功能造成的二次伤害始终是难以解决的问题，临床上称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。CIRI是一种包含了能量障碍、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等诸多环节的复杂病理过程，这些环节互为因果，相互联系，形成恶性循环，最终导致神经细胞凋亡或坏死。作为缺血后神经细胞死亡的关键靶区，线粒体功能紊乱与CIRI恶性循环的关系密切相关。目前对于CIRI恶性循环的损伤机制仍在不断探索中，而基于线粒体损伤探究CIRI的损伤机制并寻找有效的干预靶点可能是打断CIRI恶性循环的关键。

生理情况下，线粒体通过不断的分裂、融合、自噬、生成等过程维持其动态平衡，即线粒体质量平衡，这是维持正常线粒体功能的关键环节。而在急性缺血损伤后，线粒体质量平衡会被打破，主要表现为线粒体过度分裂和线粒体自噬异常。

Drp1作为调控线粒体分裂的关键蛋白，正常情况下大部分游离分布于细胞质中。缺氧损伤后，活化Drp1会从细胞质转位到线粒体表面并通过其GTPase酶活性切割线粒体磷脂双分子层，完成线粒体分裂，导致线粒体碎片化。

P62作为选择性自噬接头蛋白，是氧化应激条件下的主要防御蛋白，调控着氧化应激后线粒体碎片的自噬降解过程。线粒体膜上P62可通过与LC3结合形成自噬小体并在自噬溶酶体中降解，触发自噬流，加速蛋白聚集物的清除。

经过团队多年的临床经验以及科学研究，提出了以下三个研究目的：（1）明确在脑缺血再灌注后Drp1介导的线粒体分裂和p62介导的自噬流这两个线粒体质量失衡的关键环节是否均发生改变；（2）探究脑缺血再灌注后线粒体活化Drp1对p62介导自噬小体形成及降解的调控通路；（3）阐述Drp1-p62线粒体质量失衡通路在脑缺血再灌注损伤恶性循环中的重要作用。

1.脑缺血再灌注后，活化Drp1 会导致线粒体分裂增加、ROS堆积增多等线粒体损伤

散斑血流检测和HE炎性浸润染色均表明小鼠脑缺血再灌注MCAO模型造模成功。脑缺血再灌注后，脑组织线粒体损伤明显，主要表现为线粒体碎片增多和线粒体功能异常。WB结果显示，脑缺血再灌注后，梗死区脑皮质的Drp1-Ser616磷酸化水平明显升高，线粒体Drp1表达明显增高，细胞质Drp1表达明显减低，提示发生了Drp1的线粒体转位。免疫荧光检测脑梗死部位DRP1与COX Ⅳ共定位结果同样证实了脑缺血再灌注后Drp1向线粒体的大量聚集。在细胞水平利用OGD/R方法处理SH-SY5Y细胞后，同样观察到相同的现象，即线粒体分裂增加和ROS荧光强度增高。而这一过程与活化Drp1线粒体转位有关。通过干扰Drp1表达后发现线粒体碎片化程度明显改善，ROS荧光强度减少43%。

2.活化Drp1会加速脑缺血再灌注后p62介导的线粒体自噬小体的形成

免疫荧光结果显示，脑缺血再灌注后，脑梗死区域p62与COX IV标记的线粒体共定位情况减少48%，而使用Mdivi-1抑制Drp1活性后，p62与COX IV共定位情况提高40%。LC3和线粒体p62的WB结果同样证实了Drp1会加速p62的线粒体分离。我们使用Drp1和p62质粒转染SH-SY5Y细胞，结果发现，正常情况下Drp1弥散分布于细胞质中，而p62呈线粒体型大量分布在线粒体上。使用OGD/R在细胞水平模拟脑缺血再灌注后，发现Drp1发生线粒体转位同时p62由线粒体型转为游离型，干扰Drp1后线粒体p62明显增多。上述结果提示，脑缺血再灌注后，尽管活化Drp1并不能抑制p62的表达，但是可以促进p62从线粒体型向游离型的转变。

3.脑缺血再灌注后，活化Drp1引起ROS堆积会激活RIP1/RIP3通路，阻止自噬小体的降解

我们通过mRFP-GFP-LC3检测完整自噬流后发现，正常情况下，自噬小体可以被溶酶体酸性环境吞噬形成自噬溶酶体表现为RFP-GFP明显增加，提示自噬流顺畅。经过OGD/R处理后，过度增加的自噬小体（GFP）无法被溶酶体酸性环境消耗，RFP-GFP明显减少，提示OGD/R后p62介导的自噬小体无法向自噬溶酶体转变。使用ROS清除剂NAC预处理OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞后可发现自噬小体向自噬溶酶体转变情况明显改善，并且呈剂量依赖性。有研究显示，RIP1/ RIP3通路对于自噬流的正常运行具有重要意义。我们发现，OGD/R处理的SH-SY5Y细胞中RIP3磷酸化水平明显增高，RIP1与RIP3的结合力明显增强。而使用NAC清除ROS后发现RIP3活性及与RIP1的结合情况明显改善。而进一步使用RIP1/3通路抑制剂Nec-1后，可以明显促进自噬小体与自噬溶酶体的融合，促进P62介导自噬小体的降解。

4.脑缺血再灌注后，大量未降解的自噬小体会被外泌体/微囊泡包裹分泌到细胞外引起炎症反应

尽管我们前期研究显示，脑缺血再灌注后，活化Drp1引起ROS堆积会通过RIP1/RIP3通路抑制自噬小体降解，但是电镜观察并未发现自噬小体大量堆积现象。我们在细胞水平同样证实未降解的P62介导的自噬小体并没有在OGD/R处理的SH-SY5Y细胞中形成蛋白聚集小体，出现自噬小体堆积。那么大量未降解的P62自噬小体的去向问题引起了我们的注意。我们对以往公共数据库中所有脑缺血再灌注模型测序数据进行GO功能富集分析，发现脑缺血再灌注后细胞器膜性结构异常活跃，可能表现为大量外泌体膜性结构的释放。我们对梗死灶周围组织样本进行外泌体抽提，电镜检测到大量直径为50-100nm单层膜性结构，证实脑缺血再灌注后确实出现大量外泌体释放。而使用Drp1抑制剂Mdivi-1预处理可以明显减少外泌体单层膜性结构数量，提示脑缺血再灌注后活化Drp1对于外泌体/微囊泡释放的促进作用。此外，NTA粒径分析除了进一步证实了活化Drp1对于外泌体/微囊泡释放的促进作用外，还发现外泌体/微囊泡直径明显增大，提示其中包裹的物质要比正常组多，而抑制Drp1后外泌体/微囊泡直径明显缩小。

5.脑缺血再灌注后，包裹有p62的外泌体引发炎症反应又会进一步刺激RIP1/RIP3通路，阻止自噬小体降解，形成恶性循环

我们观察梗死灶周围CD63标记的外泌体和p62标记的自噬小体的共定位情况，结果显示脑缺血再灌注后大量释放的外泌体/微囊泡中包裹有p62自噬小体，而抑制Drp1后CD63与p62共定位情况减少47%。我们进一步通过WB检测提取的等量外泌体中p62含量，结果发现抑制Drp1可以减少包裹有p62自噬小体的外泌体的释放。炎性因子试剂盒检测发现，包裹有p62自噬小体的外泌体会促进SH-SY5Y细胞炎症介质比如TNF-α和IL-1β的分泌，并且会导致RIP1/3活性进一步增强，而使用RIP1/3通路抑制剂Nec1后可以改善脑缺血再灌注后外泌体/微囊泡刺激对自噬小体降解的抑制作用。

本研究中，我们发现CIRI后线粒体活化Drp1一方面会加速p62介导的自噬小体的形成，另一方面通过RIP1/RIP3通路阻止自噬小体向自噬溶酶体转变。而未降解的自噬小体会以外泌体/微囊泡的形式分泌出细胞外引发炎症级联反应，会进一步损伤线粒体导致ROS堆积加重和自噬小体降解受阻，形成恶性循环。

本研究从线粒体质量失衡的角度阐述了脑缺血再灌注（CIRI）后继发损伤恶性循环的机制，将CIRI后线粒体过度分裂、ROS大量堆积、线粒体自噬异常、外泌体释放增加以及炎症反应过度激活等多个病理生理过程完整联系起来。本研究在一定程度上解释了CIRI后氧自由基和炎症介质造成脑继发性损伤恶性循环的机制。如果无法维持Drp1介导的线粒体稳态以及p62介导的线粒体自噬正常运行，那么包裹有未降解p62自噬小体的外泌体的大量释放会通过促炎作用加剧缺血再灌注的恶化。本研究表明通过调节RIP1/RIP3通路加速p62自噬小体转换和破损线粒体清除可能是改善CIRI恶性循环的有效措施，而维持线粒体质量平衡和减少线粒体ROS堆积（包括减少ROS生成和增加ROS清除等）可能是从根本上改善CIRI预后的关键。

本文中Drp1 干扰腺病毒、Drp1-S616D 和 Drp1-S616A 过表达腺病毒及外泌体浓度粒径(NTA)检测均由上海吉凯基因提供。

段晨阳，临床医学博士，博士后，重庆医学会麻醉学分会青年委员。长期从事围术期危重症多器官功能损害与保护相关临床工作和科学研究。主持国家自然科学基金青年基金1项、中国博士后面上项目1项，入选 “重庆市博士后创新人才支持计划”，获得军队科技进步二等奖1项。目前以第一作者或通讯作者发表论文15篇，累计影响因子132.85分。其中10分以上SCI论文3篇（IF分别为34.91、32.98和11.80），Q1区高质量SCI论文8篇，目前总引用次数413次。参编Springer Nature和中华系列危重症领域权威专著3部。担任《Anesthesiology and Perioperative Science》学术编委。担任Autophagy、Stem Cell Research & Therapy、Frontiers in Pharmacology、Frontiers in Immunology、Frontiers in Bioscience等期刊审稿人。联系方式：duanchenyang1991@cqmu.edu.cn

李涛，陆军特色医学中心战伤休克与输血研究室主任，研究员，博士研究生导师。聚焦于休克器官功能损害的病理生理机制研究。主持国家自然基金重点项目1项、面上项目3项，主持全军十三五重大项目、全军后勤科研重点项目等，获得国家科技进步二等奖、重庆市自然科学一等奖等，以第一作者或通讯作者在Annals of surgery 、Redox Biology、Anesthesiology、Critical Care Medicine等高水平杂志发表论文70余篇。联系方式：lt200132@163.com

黄河，重庆医科大学附二院麻醉科主任，主任医师，博士研究生导师。聚焦于围术期器官保护、生物节律与麻醉的临床工作和科学研究。主持国家级项目4项，省部级项目4项，总经费1300余万元。获省部级医疗技术一等奖1项，三等奖3项。以第一作者或通讯作者发表论文68篇（IF>10四篇）。担任《Anesthesiology and Perioperative Science》学术编委；《局解手术学杂志》副主编；担任autophagy、Journal of Nanobiotechnology、Journal of stem cells等期刊审稿人。联系方式：huanghe@cqmu.edu.cn