Molecular Cancer (IF=41): 郑州大学团队发现LSD1缺失可降低外泌体PD-L1并恢复胃癌对T细胞杀伤响应

近日，郑州大学郑一超及刘宏民教授作为共同通讯作者，在Molecular Cancer（IF=41）在线发表了题为“LSD1 deletion decreases exosomal PD-L1 and restores T-cell response in gastric cancer”的研究论文，该研究发现在胃癌GC标本中，LSD1的表达与CD8的表达呈负相关，与PD-L1的表达呈正相关。进一步研究表明，LSD1通过诱导PD-L1在外泌体中的积累来抑制GC微环境中T细胞的反应，而膜PD-L1在GC细胞中保持不变。使用外泌体作为载体，LSD1 还阻碍了其他癌细胞的 T 细胞反应，而 LSD1 缺失挽救了 T 细胞功能。研究发现，虽然依赖于供体细胞中 LSD1 的存在，但外泌体可以调节小鼠前胃癌细胞 (MFC) 的细胞增殖，其作用取决于外泌体 PD-L1 介导的体内T细胞免疫。

1. LSD1缺失（Knockout，KO）可通过促进T细胞介导的免疫应答抑制胃癌肿瘤生长

作者在利用数据库对LSD1与胃癌免疫微环境中各免疫细胞的浸润及相关基因的相关性分析中发现LSD1与胃癌免疫浸润T细胞存在负相关关系。利用免疫正常小鼠和T细胞缺陷小鼠的胃癌细胞移植瘤模型进一步确认LSD1缺失可以通过T细胞抑制胃癌的发展。同时在体外构建的胃癌细胞与T细胞共培养模型中验证了LSD1缺失可以增强T细胞对胃癌细胞的杀伤功能，初步确定了LSD1在胃癌免疫微环境中能够通过T细胞促进胃癌发展。

2. 胃癌病人组织和细胞中LSD1与程序性死亡因子配体1（Programmed death ligand，PD-L1）存在正向调控关系

作者通过对胃癌病人组织中LSD1与T细胞相关蛋白的表达分析中发现，LSD1与CD8呈负相关关系且LSD1与PD-L1的表达呈正相关关系。在胃癌细胞中，LSD1缺失可以降低PD-L1的mRNA水平和总蛋白水平，而PD-L1在细胞膜的表达变化不明显。由此结合前期发现说明LSD1对PD-L1介导的T细胞功能抑制作用的调节并不是通过细胞间直接作用发生的，可能存在其他间接途径的调节机制。

3. LSD1缺失可以降低胃癌细胞外泌体中PD-L1的含量

基于前期LSD1对PD-L1调节的发现，作者利用差速离心法提取了胃癌细胞分泌的外泌体，并使用透射电镜、纳米粒子追踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）、蔗糖密度梯度离心法以及GW4869阻断实验共同验证了PD-L1包含于胃癌细胞分泌的外泌体中。LSD1缺失可以显著降低胃癌细胞外泌体中PD-L1含量，同时也降低了胃癌细胞外泌体的分泌，且LSD1缺失可以通过抑制PD-L1经过外泌体分泌途径从而维持细胞膜PD-L1表达。

4. LSD1缺失阻断胃癌细胞外泌体PD-L1对T细胞功能的抑制作用

作者在探索LSD1对外泌体PD-L1功能的调节中发现胃癌细胞外泌体可以通过PD-L1发挥与程序性死亡因子（Programmed death 1，PD-1）和T细胞结合的功能，而LSD1缺失则可以降低此结合能力，因此能够消除胃癌细胞外泌体PD-L1对T细胞活化、增殖以及对肿瘤细胞杀伤功能的抑制作用。

基于外泌体的物质传递功能，通过将胃癌细胞分泌的外泌体与受体细胞共孵育，作者验证了胃癌细胞外泌体能够与受体细胞融合并将PD-L1传递至受体细胞中，进而增加受体细胞PD-L1的含量，并增强受体细胞与PD-1的结合能力。同时传递至受体细胞的PD-L1可以增强受体细胞的免疫逃逸功能，引起受体细胞对T细胞杀伤的耐受，表现出较强的免疫抑制功能。LSD1缺失后，由于其对外泌体PD-L1的下调作用，可以消除胃癌细胞外泌体对受体细胞PD-L1的表达影响，阻断了其对受体细胞免疫逃逸功能的促进作用，恢复了胃癌细胞对T细胞的响应。

5. 615小鼠体内LSD1缺失的胃癌细胞通过外泌体PD-L1促进T细胞介导的肿瘤免疫

在动物水平上，来源于MFC细胞的外泌体可以通过PD-L1促进肿瘤生长，降低肿瘤浸润CD8+T细胞比例和肿瘤组织CD3和CD8的表达，抑制T细胞杀伤因子的分泌。而来源于MFC LSD1 KO细胞的外泌体则表现出相反的结果。且外泌体对这些表型的影响可以被PD-1蛋白阻断，证明了LSD1缺失可以通过对外泌体PD-L1的减少发挥免疫重构的作用。

本研究中LSD1 CRISPR/Cas9 KO 单载体慢病毒：U6-sgRNA-EF1a-Cas9-FLAG-P2A-puro和U6-sgRNA-SFFV-Cas9-FLAG-P2A-mCherry用于LSD1基因敲除慢病毒由吉凯基因提供。

郑州大学郑一超及刘宏民教授作为共同通讯作者，博士生申丹丹为第一作者。