exo+snRNA-seq（外泌体+单细胞核测序）助力更系统、更深入、更精准的生物学研究

2022-06-30 19:40:26, 星标关注上海欧易生物医学科技有限公司

生命的本质是不同类型细胞的互作网络，其中多样化的信号分子决定了细胞的功能，影响细胞间的相互作用，定义了网络的特性，进而展现出多姿多彩的生命现象

点击打开

多细胞有机体是由众多不同类型细胞构成的“集合”，组织或器官的发育、机体的内稳态平衡（homeostasis）等均有赖于不同细胞之间通讯（cell-cell communication）。正是通过不同的信号分子，各种各样的细胞才能井然有序的彼此协调一致，从而展现出多种多样的生命现象【1,2】。因此，生命的本质是不同类型细胞间的相互作用网络。处于这一网络中的单个细胞时刻接收外部的各种信号，并通过转录调控来对其作出响应，从而达成执行不同功能、完成不同生理（或病理）作用的目的。从这个意义上来说，外部信号与细胞内部转录的“互动”，决定了细胞的身份与功能，如B细胞发育过程中众多信号对其转录的调控【3】，决定了B细胞的功能，并在不同的生理或病理状况下发挥相应的作用。因为这种调控作用的存在，研究细胞间通讯信号的最常规手段是检测基因表达【[4],5】。采用这种方式的深层次原因是，对单个生物体来说，机体中所有细胞拥有相同的基因组，而特定细胞只会表达整个基因组的一部分，因此转录组是细胞类型特异性的（cell type-specific），而且相对蛋白组、脂质组等其它类型的大分子，转录组在技术上更容易进行监测【6】。

单细胞测序是解析细胞功能最强大、最精准的技术手段

点击打开

单细胞转录组测序（scRNA-seq, single cell RNA sequencing）业已成为生命科学研究中最为强力的技术手段。它通过鉴定细胞的分子调控模式和状态变化（state transition），为我们理解生命的细胞互作网络提供了单细胞分辨率的系统性洞见。近年来单细胞测序文献的持续快速增长，Nature Methods杂志2013年将其评选为年度技术【7】，并又在2019年将单细胞多组学技术评选为年度技术【8】，2018年Science杂志同样将其评为年度突破【9】，基于单细胞测序的国际合作研究计划的开展【10,11】，这些情况充分证明了该技术对生命科学研究的重要性。对于细胞间通讯的相关研究，单细胞转录组测序也已带来了革命性的变化【5】，为我们深入理解生命现象的分子机制提供了无与伦比的细节。

外泌体miRNA是最为关键的信号分子之一，在各种生理、病理过程中发挥着至关重要的调控作用

点击打开

外泌体（Exosome）因其在各种生理过程或疾病进展（特别是肿瘤发生、发展、转移）中所扮演的重要调控作用，越来越受到基础研究和临床研究的重视，已成为临床检测及治疗最具前景的领域【12】，特别是近来组织外泌体越来越受到研究者的重视【13】。外泌体所携带的众多“货物”中，miRNA（microRNA）是最为重要的信号分子，它通过转录水平乃至表观水平的调控【14，15】，深刻影响细胞的各种功能，在不同生理或病理过程中发挥关键作用【16,17】。例如脂肪组织巨噬细胞（ATM, Adipose Tissue Macrophage）通过外泌体中含有的miR-690调控肌肉、肝脏等组织、器官的葡萄糖耐受能力（glucose tolerance）及对胰岛素的敏感性（insulin sensitivity），以此来控制机体的胖瘦状态【18】。骨髓来源的间充质干细胞（BMSC, Bone marrow-derived mesenchymal stem cell）通过释放外泌体，以其荷载的miR-193A-3p, miR-210-3p和miR-5100增强上皮癌细胞的入侵及间充质转化（EMT, Epithelial–Mesenchymal Transformation），进而促进肿瘤恶化【19】。因此，对miRNA的研究已成为疾病诊断、临床检测等领域的热点【20】，是众多研究关注的核心。

单细胞转录组与外泌体miRNA的“联合”，大大促进了对生命现象背后分子机理的深入解析，成就高质量、高水平研究

点击打开

单细胞转录组能够明确细胞的功能，即细胞互作网络中节点的特性；外泌体miRNA可以获知细胞间传递的信息，即细胞互作网络中的通讯信号，两者的结合能够“重构”完整的细胞互作网络，从而深入揭示生命现象背后的分子机制。例如在对乳腺癌他莫昔芬耐药性（Tamoxifen resistance）机制的探索中，研究者结合单细胞转录组测序及外泌体miRNA分析，发现CD63阳性的癌症相关成纤维细胞（CD63+ CAF,CD63+ Cancer-Associated Fibroblast）通过其自身分泌的外泌体中所包含的miR-22来降低癌细胞中雌激素受体α（ERα, Estrogen Receptor α）的表达量，从而减轻癌细胞对他莫昔芬的敏感性，导致耐药的出现【21】。基于这一结果，作者利用CD63中和抗体及能够吸收miR-22分子的纳米颗粒（cRGD-miR-22-sponge nanoparticles），在小鼠模型中成功的提升了乳腺癌细胞对药物的敏感性，从而为解决他莫昔芬耐药这一临床难题提供了深入的分子机制和精准的解决方案。无独有偶，肝内胆管细胞癌（ICC, Intrahepatic cholangiocarcinoma）的单细胞转录组研究同样结合了对外泌体miRNA的分析【22】，作者不仅深入揭示了肿瘤的细胞图谱，而且鉴定到肿瘤细胞（ICC cell）利用外泌体中的miR-9-5p调控vCAF (vascular cancer-associated fibroblast)细胞中IL6的表达，进而形成更利于肿瘤细胞增殖的微环境，加速疾病恶化。这为开发新的临床治疗方案提供了全新的思路与方向。另外，在对间充质干细胞治疗肝硬化的研究中，作者同样结合外泌体检测与单细胞转录组测序，揭示出外泌体改善肝硬化症状的“细胞学基础”，发现巨噬细胞在这一过程中的转录调控细节，为进一步优化治疗方法提供了精准依据【23】。这些高水平研究为疾病进展的分子机制提供了深刻的洞见，为临床检测和治疗明确了更精准有效的方向和方法，开启了临床应用新的篇章，革新了我们开展研究的方式方法，意义深远。

当前的技术空白导致了外泌体miRNA及单细胞测序只能相互独立进行，大大限制了通过两者的有机结合来挖掘更深入的分子机制

点击打开

尽管外泌体miRNA与单细胞转录组的联合研究能够深入的揭示细胞互作网络的运行机制，但当前的技术方法只能分别检测外泌体miRNA及单细胞转录组，也就是无法在同一份样品中同时获取这两种数据，这大大限制了两者之间的有机联系，很难彼此协同，彼此互为补充与支撑，从而导致这种联合研究的真正威力无法完全发挥。例如上述的研究案例中【21,22】，均是先通过单细胞转录组寻找到特定细胞类型，然后再通过分选及体外培养方式，检测这些培养细胞上清中的外泌体。由于培养条件与体内环境的巨大差异，这些外泌体无法真实的反映细胞在组织中的状态，因此可能造成假阳性和遗漏的情况。也有研究同时鉴定单细胞外泌体及单细胞转录组【24】，但同样是体外培养环境，很难反映细胞在组织和器官中的真实状态。目前在Pubmed数据库中检索“exosome single cell RNA sequencing”，仅有54篇相关文献，且绝大部分并不是同时对外泌体及单细胞转录组进行检测。这与单独检索“single cell RNA sequencing”或“exosome”均能查找到20000以上的文献形成了鲜明对比，从侧面说明了目前技术空白对这种联合研究方式造成了较大的限制。

exo+snRNA-seq填补了现有技术空白，通过同时测序同一组织中的外泌体miRNA和单细胞核转录组，为挖掘更系统、更深入、更精准的生物学机制提供新的机遇

点击下方展开查看具体内容

点击打开

exo+snRNA-seq是指exosome + single nucleus RNA sequencing（外泌体+单细胞核测序），是借由特殊的样本处理方法，实现在同一份样本中分别纯化和制备组织外泌体和单细胞核悬液，从而达成同时测序同一组织中单细胞转录组及外泌体small RNA的目的（图1），突破了现有技术方法的障碍，填补了当前的技术空白，解决了外泌体miRNA与单细胞转录组联合研究无法有机结合、彼此形成合力的问题，更有助于揭示深层的机制。例如上述乳腺癌的案例中，CD63+CAF的来源是什么？解答这一问题对进一步深挖肿瘤发展的动态机制非常关键。已知多种类型的细胞均具有分化为CAF的能力，如组织内静止成纤维细胞、内皮细胞、间充质干细胞、脂肪细胞等，通过单细胞转录组来追踪和确定CAF的这些来源，是当前最为有效和精准的手段【25】。STAT3是维持CD63+CAF最重要的转录因子【21】，而STAT3本身可能受到多个miRNA的调控【26】，如miR-551b-3p调控STAT3表达升高【27】, miR-18a【28】、miR-221和miR-222【29】调控表达降低。如能以exo+snRNA-seq，在更早时间点进行检测，通过分析CAF可能来源的细胞类群的转录模式及差异表达基因，并将相关基因与组织中检测到的miRNA进行共表达分析（gene coexpression），即可明确是何种miRNA信号分子，作用于哪些细胞类型，通过哪个信号通路，使其转变为CD63+CAF细胞。进一步的，也可以通过分析特定类型细胞差异表达miRNA靶标的情况，来明确还有哪些细胞类型受到调控。另一方面，可以通过Gene Ontology中Exosome通路富集分析【[30]】，明确是哪些细胞正在分泌外泌体，从而获知是何种细胞类型可能分泌miRNA来调控特定细胞转变为CD63+CAF细胞。此外，特定miRNA包装进入外泌体有其特异性的调控因子，如miR-22必须依赖SFRS1【21】，这样可以进一步分析特定细胞类型中与miRNA合成及包装相关的基因，从而更准确的找到是哪种细胞分泌外泌体。通过这一系列的分析，就能够更加精准的明确具体的细胞间调控关系、其相应的信号分子以及细胞响应的转录模式。例如在CD63+CAF的例子中，可能是特定的乳腺癌细胞亚类通过miR-551b-3p来调控组织中静止成纤维细胞，使其STAT3持续上调，从而进一步转变为促进肿瘤耐药的CD63+CAF。这一转变过程中涉及的相关信号通路和特定的细胞表达模式，均可通过exo+snRNA-seq进行特异性的挖掘，从而更详尽的明晰乳腺癌耐药的分子机制，更动态的阐明耐药的整个前因后果，为开发更加有效的早期治疗乃至预防方案提供精准依据。

综上所述，exo+snRNA-seq同时检测同一份样本中的外泌体miRNA及单细胞转录组，能够获取更充分的数据、更丰富的信息，从而在更高阶的维度上通过更多样的组合，使数据之间更有机的结合，彼此协同、互为支撑与补充，为我们揭示细胞互作网络提供更系统的“全景”、更深入的原理和更精准的机制。

图1 exo+snRNA-seq基本流程图示

exo+snRNA-seq以速冻组织为样本，首先根据送样条件会选择进行一步RNA质控，以检测送样或取样过程是否引起RNA降解。接下来会以特定的缓冲液浸没样本后开始进行裂解和匀浆，以释放细胞核及外泌体。将离心后的上清和沉淀分别收集，进行外泌体纯化以及单细胞核悬液制备。其中外泌体纯化及RNA抽提均通过QIAGEN相关试剂盒进行，以保证稳定的质量。抽提好的miRNA随后以常规流程完成建库和测序。沉淀以细胞核制备裂解缓冲液进行重悬，再进行纯化等步骤后，以10x Genomics相关流程进行单细胞核测序。

写在最后：两大标志物的“联手”，将为更精准有效的临床检测和治疗方案带来革命性的提升

点击打开

细胞是生命活动的基本功能单位。细胞之间以多种多样的通讯信号彼此协调一致，从而展现出异彩丰呈的各类生命现象。为了深入理解细胞互作网络的运行机制，我们仅仅知道单个细胞的功能是远远不够的。就像要了解一个团队或组织的运作机制，我们仅仅知道其中的每个人的责任和分工是不够的，他们之间如何沟通和协作更加重要，也就是相互之间的信息是如何传递，以及每个人如何响应特定信号。exo+snRNA-seq通过同时揭示细胞功能及其通讯信号，为我们理解生命现象的本质带来了全新的维度和机遇，特别是在临床检测与治疗领域。一方面，随着近年来的快速发展，单细胞转录组测序已成为挖掘精准、特异、高效的生物标志物的基本方法【31】。另一方面，miRNA一直以来都是临床标志物研究关注的核心与重点【20】。exo+snRNA-seq将两大标志物联合起来，产生更多样的数据分析的“有机组合”，未来将革新临床检测和治疗手段，帮助我们攻克各种疾病，为人类健康与发展带来福祉。

欧易exo+snRNA-seq技术服务

欧易生物是国内最早开展单细胞测序的公司之一，在国内首批推出单细胞核测序服务。目前拥有10x Genomics及BD Rhapsody两个单细胞测序平台，以及完整、系统的生物信息学分析技术和流程，竭诚为广大用户提供高质量的单细胞测序服务。

经过技术开发与沉淀、持续优化及改进，现推出exo+snRNA-seq服务，协助各位老师进行更深入、更系统的研究。该方法目前适用于大多数种类的动物样本组织，包括小鼠肾、肺、心、肝等组织，人类各种癌症组织，均取得了良好的效果，部分结果如（图2、图3）所示。欢迎各位老师垂电咨询。

图2 以小鼠肺及肾为样本进行单细胞核测序验证。

镜检结果表明细胞核状态良好，碎片、结团、细胞核总量、浓度等指标均满足上机要求。单细胞核测序结果表明细胞类群完整，各类别细胞均能检测到且相互比例符合组织自身特性。

图3 以小鼠肺及肾为样本同时进行外泌体miRNA测序验证。

电镜结果显示能够观察到典型的“杯状”外泌体囊泡结构。以纳米流式对纯化的外泌体进行粒径分析，结果同样表明粒径符合典型的外泌体直径大小，且杂质很少，纯度较高。测序结果显示能够检出的miRNA数量均正常，符合组织特征。

FAQ

1、取样及样本寄送有什么要求？

取材时，组织离体后在冰上预冷的PBS中稍稍漂洗，将表面的血液洗净，用吸水纸或擦镜纸将组织表面的残留缓冲液尽量吸干，再将组织装于冻存管中，直接投于液氮中。速冻30分钟以上后可转移至-80℃冰箱中保存。运输时以干冰进行寄送。

2、为什么选择snRNA-seq（ single nucleus RNA sequencing ）而不是scRNA-seq（single cell RNA sequencing）？

首先，最重要的原因是“细胞活性”。因为解离组织的过程中，细胞仍保持着代谢活性，可能释放及吸收外泌体，特别是在酶解这样强烈的外接刺激下更是如此。这会对后续数据的真实性和可靠性造成非常大的影响，导致检测结果“失真”。其次，解离过程使用的酶解液会对外泌体造成较大影响，可能使囊泡结构“崩解”，从而导致很难纯化到高质量的外泌体，或者造成大量损失。经过我们前期大量验证，比较了多种酶解条件和组合，结果也较多的证实了这一点。另外，37℃酶解环境即使不对囊泡结构造成损伤，也会对其中的RNA造成很大影响，有极大的降解风险。而制备细胞核全程处于低温环境下，不存在这个担忧。

3、使用细胞核进行测序相比完整细胞丢失了很多细胞质中转录本，会不会对结果有什么影响？

之所以会以细胞核代替完整细胞（whole cell）进行单细胞转录组测序，主要是因为随着大量应用的展开，使用whole cell（scRNA-seq）逐渐显示出一些固有的方法学问题，主要有三点。

第一，仅适用于新鲜组织样本，对于冻存样本，由于细胞已经丧失活性，因此无法开展scRNA-seq。这一点极大的限制了单细胞测序技术的应用范围，同时也增加了操作的难度。

第二，解离过程会诱导应激基因的表达【32】，引起细胞转录模式发生“人为改变”（artifactual transcriptional stress responses），造成转录偏好（bias）。这样获得的数据无法真实的反映样本的细胞转录状态，结果的可靠性大大降低。

第三，对于很多实体组织，如脑、心脏、肾脏等，蛋白酶倾向于将易于解离的细胞类型解离下来，因此会丢失不易解离的细胞；同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎。这样，解离过程无法有效的获取到组织中的所有细胞类型，结果的准确性大为降低，如上皮细胞在37℃解离过程中大量“丢失”【33】。而采用细胞核进行单细胞转录组测序（snRNA-seq）则很好的解决了以上问题，具有很大优势：

第一，可以进行冰冻样本操作，使样本类型大大扩增（如医院冻存的很多临床样本），且操作步骤大为简化而稳定。

第二，不会引入人为的转录偏好。冻存组织中细胞的转录组是被“冻结”于采样的时间点，细胞已基本丧失活性，不会再发生转录变化。因此，snRNA-seq不会出现转录偏好的情况，测序结果能够真实反映采样时间点的细胞转录模式，从而获知最为准确的细胞转录状态【34】。

第三，由于采用机械法和化学试剂破碎细胞，snRNA-seq不会出现酶解方法的偏好性，能够鉴定到的细胞类型更为全面和完整，所有细胞类型均能够得到有效回收和鉴定，帮助研究人员获取更加完整和全面的细胞图谱。大量、持续的文献研究已证明，使用细胞核测序和whole cell没有区别，在解答生物学问题中能起到同样的作用，例如近期发表的，在脑组织损伤研究【[35]】和肿瘤治疗评估研究中【36】，snRNA-seq均能够解答深入的机制性问题。详细信息可以参考BioArt 公众号2020年8月12日、欧易公众号2020年8月18日文章：《一篇文章终结你对单细胞核测序的所有困惑》。

另外，在外泌体miRNA这个应用场景下，相对scRNA-seq，snRNA-seq具有一定的优势。

第一，snRNA-seq能检测更为准确的细胞比例，在刻画细胞互作网络的全景图中更为有利，其结果更加完整、准确。

第二，miRNA调控的细胞功能转变是在转录水平，而不是转录后水平。例如上述他莫昔芬耐药性的研究案例中，CD63+CAF受转录因子STAT3的持续调控才能维持其细胞功能。对于转录水平的变化，测序细胞核内的RNA相对细胞质中的RNA要更“精准”一些，因为核内RNA更能反映细胞接收到miRNA信号调控后“即时”的动态变化。

4、能同时做血液的外泌体么？

当然可以，这主要取决于想要解答的生物学问题。一般说来，血液中外泌体主要用来作为标志物进行检测和筛选。也可以比较癌组织中的外泌体和血液中外泌体的差异，用来解答诸如癌细胞迁移的组织偏好性（extracellular vesicle-associated organotropic metastasis）等问题。

5、能不能进行长非编码RNA等其它类型核酸的研究？

可以。不过目前我们仍然聚焦在miRNA中，主要是因为miRNA目前的研究积累更为深厚，能够助推新技术的应用，特别是在深入阐释生物学意义的过程中，更有助于帮助老师挖掘数据背后的模式和解答所关注的生物学问题。

6、能不能同时进行外泌体的蛋白组学研究？

理论上没有障碍，最大的困难可能在于样本量不足，制备到的外泌体不够同时进行核酸和蛋白研究。欧易拥有完整的全组学服务方案和相应的高质量技术体系，目前正在尝试搭建外泌体蛋白组检测流程。我们未来希望能检测所有相关的信号分子，包括mRNA、非编码RNA、蛋白质甚至脂质等分子，从而形成单细胞通讯组学（Single Cell Communicatomics）这一新的高通量测序检测方法，为基础研究、临床检测等开辟新思路、新领域。

7、数据分析都包括什么内容？

目前分析内容包括三大部分，即miRNA测序分析、单细胞核测序分析和两者联合分析，其中两者联合分析较为倾向于个性化。特别是目前较为缺少前期研究的情况下，两者联合分析尚缺少较为明确的“套路”，需要结合具体生物学问题进行分析。欢迎各位老师在这一方面更多提出宝贵意见。

7.1 miRNA测序常规分析及报告

包括（1）已知miRNA比对统计；（2）差异miRNA筛选结果；（3）差异miRNA靶基因预测结果；（4）靶基因KEGG富集结果；（5）靶基因GO富集结果；（6）差异miRNA筛选参考文档等。

7.2 单细胞核测序常规分析及报告

包括常规单细胞分析的（1）降维与聚类；（2）细胞类型鉴定；（3）差异基因和差异基因功能分析；（4）拟时序分析；（5）细胞间通讯网络分析（基于配体-受体对）等。

7.3 miRNA及单细胞转录组联合分析

也包括三种主要内容：

7.3.1 挖掘哪些细胞受到miRNA的调控。7.3.1.1 miRNA与细胞转录组的共表达分析：是指将外泌体miRNA与全部细胞或特定类型细胞基因表达量进行共表达分析，构建共表达网络（coexpression network），再对特定miRNA的共表达基因中，挑选数据库中与该miRNA靶标基因“重叠”的基因。

7.3.1.2 筛选差异表达基因：特定生理或病理过程中特定miRNA响应相关基因在哪些细胞中差异表达，从而更加针对性的挖掘哪些细胞受到外泌体的调控。

7.3.1.3 不同类型细胞中是否表达相关miRNA的靶标基因或不同细胞类型中的差异表达基因是否为相关miRNA的靶标，例如肺癌微环境中的相关应激基因【37】，可将这些基因挑选出来，鉴定其在特定细胞中的差异表达，从而明确哪些细胞受到miRNA的调控。

7.3.2 挖掘哪些类型的细胞正在分泌外泌体。7.3.2.1 在全部细胞或特定类型细胞转录组中进行外泌体相关GO通路富集分析【30】，确定哪些细胞中相关GO通路被上调，从而确定哪些细胞正在分泌外泌体。

7.3.2.2 特定生理或病理过程中外泌体合成相关基因在特定细胞中的差异表达：目前已大量鉴定到关于外泌体合成的相关因子，可将这些基因挑选出来进行差异表达分析或确定是在哪些细胞中表达，从而确定是哪些细胞正在合成、分泌外泌体。

7.3.2.3 “抽取”外泌体合成相关基因来进行细胞的降维聚类，即将外泌体合成相关基因的表达量数据从总的转录数据中单独抽取出来，以它们的表达量对细胞进行聚类分析，从外泌体合成的这个角度对细胞类型进行深入分析。

7.3.3 联系生物学过程进一步深入挖掘与阐释。7.3.3.1 不同细胞之间的调控关系，即根据病理或生理过程，联系挖掘到的分泌外泌体与受到调控细胞之间的关系（分泌miRNA→受到调控），来阐释数据的生物学意义。

7.3.3.2 结合细胞间通讯网络分析结果（配体-受体对）详细阐释整个调控网络，例如上述肝内胆管细胞癌的例子中，miR-9-5p调控vCAF细胞中IL6的表达。

7.3.3.3 其它。例如癌与癌旁中相关差异表达miRNA及细胞类型差异表达基因；癌与癌旁中细胞之间的调控关系（癌细胞分泌miRNA→癌旁细胞受到调控）；体液中miRNA与肿瘤组织中miRNA筛选差异表达miRNA，寻找生物标志物等等。具体可根据想要解答的生物学问题或者临床问题来深入讨论和进行实验设计。

关于欧易

2009年，从基因芯片技术入手，本着为客户提供优质而有温度的高端技术服务这一简单想法，欧易开启了事业征程。十年来，沐风栉雨，初心不改，从文库技术到基因芯片技术、二代测序技术、三代测序技术、、单细胞测序技术、质谱技术，我们一直在高端组学技术领域开拓前行。通过技术开发、流程优化、精良设备引进、优秀人才聚集、持续管理提升，欧易建立起了行业一流的质量标准以及严格的质控体系，并始终秉承“硬数据，好服务”的一贯追求，为客户提供优质的高端技术服务。

欧易先后获得Agilent、 Affymetrix、Pacbio、10x Genomics在中国的认证服务商资质，先后与中国海洋大学、中科院遗传所等建立了紧密的产学研合作，与日立诊断公司共建联合研发实验室，并先后获得“上海市高新技术企业”、“浦东研发机构”、“专精特新企业”等政府资质。

2017年，控股上海鹿明生物，实现了从基因组、转录组、表观组到蛋白组、代谢组的完整全组学技术服务；成立晶准医药，实现了从科技服务到精准医疗的跨越，在多年技术积累的基础上，全力推进分子诊断产品的研究与开发。

成立以来，欧易已经服务客户近万名，用户单位过千家，协助客户发表SCI论文数千篇，积极参与并推动了科技服务产业的发展。今天的欧易，以生物科技为核心，以科技服务、分子诊断为两大主攻方向，正昂首阔步迈向未来。

欢迎有意向开展单细胞测序研究的老师们向我们咨询沟通相关问题 （技术热线：021-34781616）

参考文献

1. M Albert Basson. Signaling in Cell Differentiation and Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Jun 1;4(6):a008151.

2. Norbert Perrimon, Chrysoula Pitsouli, Ben-Zion Shilo. Signaling Mechanisms Controlling Cell Fate and Embryonic Patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2012 Aug 1;4(8):a005975.

3. Brian J Laidlaw , Jason G Cyster. Transcriptional regulation of memory B cell differentiation. Nat Rev Immunol. 2021 Apr;21(4):209-220.

4. Zhong Yao, Julia Petschnigg, Robin Ketteler , Igor Stagljar. Application guide for omics approaches to cell signaling. Nat Chem Biol. 2015 Jun;11(6):387-97.

5. Erick Armingol , Adam Officer, Olivier Harismendy, Nathan E Lewis. Deciphering cell–cell interactions and communication from gene expression. Nat Rev Genet. 2021 Feb;22(2):71-88.

6. Stephen R Quake. The cell as a bag of RNA. Trends Genet. 2021 Dec;37(12):1064-1068.

7. Method of the Year 2013. Nat Methods. 2014 Jan;11(1):1.

8. Method of the Year 2019: Single-cell Multimodal Omics. Nat Methods. 2020 Jan;17(1):1.

9. https://vis.sciencemag.org/breakthrough2018/

10. https://www.humancellatlas.org/

11. Muzlifah Haniffa, Deanne Taylor, Sten Linnarsson , Bruce J Aronow. A roadmap for the Human Developmental Cell Atlas. Nature. 2021 Sep;597(7875):196-205.

12. Raghu Kalluri, Valerie S LeBleu. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020 Feb 7;367(6478):eaau6977.

13. Su‐Ran Li, Master, Qi‐Wen Man, MD, Xin Gao, Master. Tissue‐derived extracellular vesicles in cancers and non‐cancer diseases: Present and future. J Extracell Vesicles. 2021 Dec; 10(14): e12175.

14. Mihnea Paul Dragomir , Erik Knutsen , George Adrian Calin. SnapShot: Unconventional miRNA functions. Cell. 2018 Aug 9;174(4):1038-1038.e1.

15. Mihnea P Dragomir , Erik Knutsen , George A Calin. Classical and noncanonical functions of miRNAs in cancers. Trends Genet. 2021 Oct 30;S0168-9525(21)00286-9.

16. Roi Isaac, Felipe Castellani Gomes Reis, Wei Ying, Jerrold M Olefsky. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metab. 2021 Sep 7;33(9):1744-1762.

17. Chunyang Jiang , Na Zhang , Xiaoli Hu , Hongyan Wang. Tumor-associated exosomes promote lung cancer metastasis through multiple mechanisms. Mol Cancer. 2021 Sep 13;20(1):117.

18. Ying, W., Gao, H., Dos Reis, F.C.G., Bandyopadhyay, G., Ofrecio, J.M., Luo, Z., Ji, Y., Jin, Z., Ly, C., and Olefsky, J.M. (2021). MiR-690, an exosomalderived miRNA from M2-polarized macrophages, improves insulin sensitivity in obese mice. Cell Metab. 33, 781–790.e5.

19. Zhang X, Sai B, Wang F, Wang L, Wang Y, Zheng L, Li G, Tang J, Xiang J. Hypoxic BMSC-derived exosomal miRNAs promote metastasis of lung cancer cells via STAT3-induced EMT. Mol Cancer. 2019;18(1):40.

20. Marcelo A Mori et al., Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metab. 2019 Oct 1;30(4):656-673.

21. Yuan Gao , Xiaoju Li , Cheng Zeng , Chenlin Liu , Qiang Hao , Weina Li , Kuo Zhang. CD63+ Cancer-Associated Fibroblasts Confer Tamoxifen Resistance to Breast Cancer Cells through Exosomal miR-Adv Sci (Weinh). 2020 Sep 24;7(21):2002518.

22. Min Zhang , Hui Yang , Lingfei Wan, Zhaohai Wang , Haiyang Wang, Chen Ge. Single-cell transcriptomic architecture and intercellular crosstalk of human intrahepatic cholangiocarcinoma. J Hepatol. 2020 Nov;73(5):1118-1130.

23. Suguru Takeuchi , Atsunori Tsuchiya, Takahiro Iwasawa, Shunsuke Nojiri. Small extracellular vesicles derived from interferon-γ pre-conditioned mesenchymal stromal cells effectively treat liver fibrosis. NPJ Regen Med. 2021 Mar 30;6(1):19.

24. Mohsen Fathi , Robiya Joseph , Jay R T Adolacion, Melisa Martinez-Paniagua, Xingyue An. Single-Cell Cloning of Breast Cancer Cells Secreting Specific Subsets of Extracellular Vesicles. Cancers (Basel). 2021 Aug 31;13(17):4397.

25. Yang Chen, Kathleen M McAndrews , Raghu Kalluri. Clinical and therapeutic relevance of cancer-associated fibroblasts. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Dec;18(12):792-804.

26. Daniel E Johnson, Rachel A O''Keefe , Jennifer R Grandis. Targeting the IL-6 JAK-STAT3 signalling axis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2018 Apr;15(4):234-248.

27. Pradeep Chaluvally-Raghavan , Kang Jin Jeong , Sunila Pradeep , Andreia Machado Silva. Direct Upregulation of STAT3 by MicroRNA-551b-3p Deregulates Growth and Metastasis of Ovarian Cancer. Cell Rep. 2016 May 17;15(7):1493-1504.

28. W Wu, M Takanashi, N Borjigin, S-i Ohno, K Fujita, S Hoshino, Y Osaka, A Tsuchida, M Kuroda. MicroRNA-18a modulates STAT3 activity through negative regulation of PIAS3 during gastric adenocarcinogenesis. Br J Cancer. 2013 Feb 19;108(3):653-61.

29. Sanhong Liu, Xiaohua Sun, Mingliang Wang , Yingyong Hou, Yu Zhan, Yuhang Jiang. A microRNA 221- and 222-Mediated Feedback Loop, via PDLIM2, Maintains Constitutive Activation of NFκB and STAT3 in Colorectal Cancer Cells. Gastroenterology. 2014 Oct;147(4):847-859.e11.

30. http://amigo.geneontology.org/amigo/search/ontology?q=exosome

31. Satyen H Gohil, J Bryan Iorgulescu , David A Braun, Derin B Keskin. Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 2021 Apr;18(4):244-256.

32. Susanne C van den Brink et al., Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 2017 Sep 29;14(10):935-936.

33. Jeffrey R Koenitzer, Haojia Wu, Jeffrey J Atkinson, Steven L Brody. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 2020 Dec;63(6):739-747.

34. Elena Denisenko et al., Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 2020 Jun 2;21(1):130.

35. Anthony G Boghdadi, Joshua Spurrier, Leon Teo, Mingfeng Li, Mario Skarica. NogoA-expressing astrocytes limit peripheral macrophage infiltration after ischemic brain injury in primates. Nat Commun. 2021 Nov 25;12(1):6906.

36. O C Bedoya-Reina, W Li, M Arceo, M Plescher, P Bullova, H Pui, M Kaucka. Single-nuclei transcriptomes from human adrenal gland reveal distinct cellular identities of low and high-risk neuroblastoma tumors. Nat Commun. 2021 Sep 7;12(1):5309.

37. Bangrong Cao, Wei Dai, Shiqi Ma, Qifeng Wang, Mei Lan, Huaichao Luo. An EV-Associated Gene Signature Correlates with Hypoxic Microenvironment and Predicts Recurrence in Lung Adenocarcinoma. Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Sep 6;17:879-890.