【应用分享】三种鲜牛奶中免疫球蛋白IgG的提取与检测

2022-06-16 15:33:55

背景

根据在央视新闻和搜狐新闻客户端进行的调查“你知道常温奶和巴氏奶的区别吗？” ，调查结果显示有78.3%的人表示不知道。对于“你会买哪种牛奶？”，调查结果显示，50%的人会选冷鲜保存的鲜牛奶，33.3%的人会选择常温储存的牛奶。巴氏奶（鲜牛奶）和常温奶，他们都以新鲜牛乳为材料。但是由于灭菌方法不同而存在很多不同的地方。保质期比较长的液态奶一般为常温奶，市面上的常温奶都有“纯牛奶”的标志，常温下可以保存一个月以上，采用超高温灭菌技术加工而成，虽有一定的维生素破坏，但破坏程度很低。保质期比较短的液态奶一般为巴氏奶，消费者只能在超市的冷鲜柜中找到，包装盒上大都有“鲜牛奶”的标志，采用低温加热的巴氏杀菌法加工而成，这项已经用了两百年的杀菌方法，能最大限度的保持鲜牛乳的营养含量和良好口感，但需低温保存、保质期一般在一周内。巴氏奶还有一个大的特点，不能添加防腐剂及一切添加剂。

鲜牛奶中免疫球蛋白因其独特的功能活性，备受乳制品行业的关注，但目前乳品中免疫球蛋白的定量检测依然是难点，GB/T 5009.194-2003中使用到的HiTrap 1mL Protein G HP柱在实际检测中会出现目标物与杂蛋白难以分离、积分不准确的问题，会造成检测结果偏高；而采用我们创新性的SelectCore Protein G亲和固相萃取后，再用高效体积排阻色谱法进行分析，峰型对称、重现性好，检测结果准确可靠。本实验研究对比了两个方法的谱图及测定的数据，并且对方法的精密度、准确度进行了总结，另外也对亲和柱的使用次数进行了初步验证。

适用范围

参照GB/T 5009.194-2003 保健食品中免疫球蛋白IgG的测定，采用亲和固相萃取结合高效体积排阻色谱法。本方法适用于鲜牛奶中免疫球蛋白IgG含量的测定。

实验步骤

1、试剂的准备

0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液：使用Na₂HPO₄和NaH₂PO₄进行配置；
冰乙酸溶液：准确吸取3 mL冰乙酸定容至1 L水中，再使用低浓度的NaOH溶液调节pH至3.0。

2、样品的制备

光明鲜牛奶、光明优倍鲜牛奶、光明致优全鲜乳：准确称取试样2.0 g（精确至0.001 g），用0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液稀释至25 mL，摇匀，通过0.45 μm微孔滤膜后备用。

3、固相萃取方法

活化：SelectCore Protein G亲和柱，依次使用5.0 mL水、10.0 mL 0.05 mol/L pH6.5的PBS缓冲溶液活化；
上样：取步骤2中制备好的光明鲜牛奶溶液10 mL或光明优倍鲜牛奶、光明致优全鲜乳溶液5 mL上样至固相萃取柱上，弃去流出液；
淋洗：使用5.0 mL 0.05 mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲溶液淋洗，弃去淋洗液；
洗脱：用4 mL 冰乙酸溶液洗脱，收集全部洗脱液，并用冰乙酸溶液定容至5.0 mL，混匀；
洗脱液直接使用高效液相色谱仪进行测定。

4、高效体积排阻液相色谱仪器条件

Column： BioCore SEC-300，5 μm
Dimension： 4.6×250 mm
Mobile Phase：150 mmol/L氯化钠溶于20 mmol/L PBS缓冲溶液中（pH7.0）
Flow rate： 0.5 mL/min
Temperature： 30 °C
Injection： 10 μL
Detection： UV 214 nm

5、GB/T 5009.194-2003方法液相色谱仪器条件

Column： HiTrap 1mL Protein G HP
Mobile Phase：

A）50 mmol/L PBS缓冲溶液（pH6.5）

B）50 mmol/L 甘氨酸盐酸缓冲溶液（pH2.5）

Gradient：t(min) A B

0 100 0

4.5 100 0

5.5 0 100

15 0 100

15.5 100 0

22 100 0

Flow rate：0.4 mL/min
Injection：20 μL
Detection：UV 280 nm

实验谱图

图1：免疫球蛋白IgG标准品高效体积排阻色谱图

图2：免疫球蛋白IgG标准品GB/T 5009.194-2003方法色谱图

图3：光明鲜牛奶高效体积排阻色谱图

图4：光明鲜牛奶GB/T 5009.194-2003方法色谱图

图5：光明优倍鲜牛奶高效体积排阻色谱图

图6：光明优倍鲜牛奶GB/T 5009.194-2003方法色谱图

图7：光明致优全鲜乳高效体积排阻色谱图

图8：光明致优全鲜乳GB/T 5009.194-2003方法色谱图

图9：光明致优全鲜乳加标（加标量：1.25 mg/g）高效体积排阻色谱图

7、免疫球蛋白IgG含量测定结果

样品名称	标示量	亲和固相萃取结合高效体积排阻色谱法测得含量	GB/T 5009.194-2003方法测得含量
光明鲜牛奶	-	58 mg/L	105 mg/L
光明优倍鲜牛奶	180 mg/L	218 mg/L	432 mg/L
光明致优全鲜乳	220 mg/L	282 mg/L	496 mg/L

8、加标回收率

样品	加标量	加标回收率
光明致优全鲜乳	1.25 mg/g	101.77%

9、进样精密度考察

实验过程中，高效体积排阻色谱法使用经SelectCore Protein G亲和固相萃取柱处理后光明致优全鲜乳进行连续进样6次处理，该分析方法的RSD为0.5%，GB/T 5009.194-2003方法使用制备好的的光明优倍鲜牛奶溶液进行连续进样6次处理，该分析方法的RSD为4.3%。

图10：SelectCore Protein G亲和固相萃取结合高效体积排阻色谱法6次进样精密度色谱

图11：GB/T 5009.194-2003方法HiTrap Protein G HP 6次进样精密度色谱图

10、可重复使用次数考察

选取同一支SelectCore Protein G亲和固相萃取柱，连续使用制备好的光明致优全鲜乳溶液进行5次上样、淋洗、洗脱、高效体积排阻色谱分析操作，测定5次重复上样峰面积的RSD为0.7%，说明亲和固相萃取柱在重复使用的情况下峰型正常、杂蛋白干扰少，保证了测定结果的重现性。

图12：SelectCore Protein G亲和固相萃取柱可重复使用次数色谱图

11、实验讨论

（1）由图1-8中两种不同方法的液相色谱结果可以看出，采用亲和固相萃取处理后的样品使用高效体积排阻色谱法进行分析的色谱结果，目标物基线平稳、峰型优良、与杂蛋白分离度高、可进行准确的积分操作；相比之下GB/T 5009.194-2003方法基线波动较大、峰型展宽严重、峰型对称性较差，因目标物与杂蛋白难以分离导致积分操作时可能会将杂蛋白默认为目标物，从而影响后续的含量计算。

（2）在免疫球蛋白IgG含量测定结果表格中可以看出，GB/T 5009.194-2003方法测得的样品中免疫球蛋白IgG含量约为实际含量的两倍，而亲和固相萃取结合高效体积排阻色谱法测得的样品中免疫球蛋白IgG含量几乎与样品标示量一致，并且SelectCore Protein G亲和固相萃取柱加标回收率符合检测要求，更加确保了检测结果的准确可靠。

（3）在免疫球蛋白IgG含量测定结果表中，光明鲜牛奶这个样品中免疫球蛋白IgG含量相对较低，如果选择GB/T 5009.194-2003方法可能会无法积分进行测定，而选择纳谱分析的SelectCore Protein G亲和固相萃取柱的亲和富集，才能使得低含量的样品也能被准确定量分析。

（4）高效液相体积排阻色谱法常用的分析柱规格是BioCore SEC-300，7.8×300mm，5μm，但考虑到有些仪器柱温箱长度限制，并且本着节约溶剂和缩短分析时间的目的，我们最后选择了BioCore SEC-300，4.6×250mm，5μm，不仅分析柱长度可以用于市面上的分析液相色谱仪器，而且分析时间也缩短了2/3，可以更加快速灵敏测定免疫球蛋白IgG。