FRONT PLANT SCI | 甘肃省农业科学院多组学揭示东方甜瓜发育过程中糖和有机酸关键调控网络

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2022年5月，欧易/鹿明生物合作客户甘肃省农业科学院程鸿团队和中国农业大学林涛团队在Frontiers in Plant Science期刊发表的题为 “Identification of Key Gene Networks Controlling Soluble Sugar and Organic Acid Metabolism During Oriental Melon Fruit Development by Integrated Analysis of Metabolic and Transcriptomic Analyses”的研究成果，采用非靶代谢组学和转录组研究方法，发现了蔗糖、D-葡萄糖、棉子糖的高积累以及相对较低的柠檬酸和苹果酸可能有助于东方甜瓜“甜宝”的甜味。

“小翠瓜”品种促进葡萄糖和果糖转化为下游过程（如糖酵解）的中间化合物。三羧酸 (TCA) 循环增强，从而导致可溶性糖和有机酸的差异积累，最终导致两个东方甜瓜品种之间的味道差异。为进一步探索甜瓜中可溶性糖和有机酸的代谢机制提供了重要信息。

东方甜瓜 ( Cucumis melo var. acidulus ) 属于葫芦科，是一种甜而芳香的甜瓜，在世界范围内广受欢迎。由于缺乏储存的淀粉储备，甜瓜果实在发育过程中需要同时供应来自叶子的光同化物来积累糖分。因此，东方瓜是研究光同化物动态变化的有吸引力的模型。甜度是甜瓜感官质量评估中的一个重要特征，由果实的代谢物组成决定，例如糖和有机酸。在甜瓜中，蔗糖是决定果实品质的主要成分；此外，糖与有机酸的比例对水果品质有显著影响。迄今为止，已经使用转录组测序、基因组工具和功能分析对甜瓜中的蔗糖和有机酸积累进行了各种研究，其中大多数只关注少数酶活性。因此，针对甜瓜果实糖份和有机酸相关的代谢和分子机制的系统研究具有重要意义。

近年来，基于多功能“组学”方法的综合分析为识别基因网络及其在生命系统中的调控机制提供了一种有效的手段。特别是转录组和代谢组的联合分析已被广泛用于识别控制植物果实中糖和有机酸积累的信号通路和机制。然而，这些综合研究阐明了控制糖分的关键基因网络香瓜果实中缺乏有机酸调节。对比品种的比较分析为鉴定控制果实品质的重要性状提供了一种有前景的方法。

在本研究中，通过全面的转录组分析和代谢物分析，作者发现东方甜瓜品种''甜宝''（A）的果实含糖量高，''小翠瓜''（B）的果实含糖量低，并同时在不同的发展阶段进行了比较。研究有助于阐明与甜瓜中糖和有机酸代谢相关的基因的动态和差异表达。

在三个成熟阶段收获两个东方甜瓜品种的果实，以研究果实中总可溶性固体（TSS）和总酸的变化（图1A）。随着果实发育，A、B品种的TSS持续积累，在S3到达峰值。[S1，开花后7天第一阶段（DAA）；S2，13 DAA；和 S3, 25 DAA]，但 A 的每个阶段的 TSS 水平显著高于 B （图1B）。此外，A果实不同发育阶段的总酸没有显著差异，而随着B果实的成熟，总酸明显增加（图1C）。TSS 和总酸的差异解释了这两个品种的天然甜度之间的差异。

进一步选择水果中任一对照组中倍数变化（FC）值≥2且FC≤0.5的差异丰度糖代谢物，并在热图中显示其变化模式（图2）。正如预期的那样，大多数糖代谢物从 AFS2 开始呈上升趋势，并在 AFS3 达到峰值，并且与 BFS3 相比，它们在 AFS3 中的积累更多，例如 D-麦芽糖、半二糖、蔗糖和 D-(+)-棉子糖。结果表明，更丰富的糖代谢物可能对 A 类水果的甜味至关重要。作者发现 D-果糖在 S2 中逐渐增加，然后在 A 和 B 中的 S3 中减少，BFS3 中的值比 AFS3 高 2.0 倍。A 和 B 水果中的 6-磷酸果糖持续下降。

作者还评估了水果中任何一个对照组中 VIP > 1 和p < 0.05的有机酸的 DAM ，并在热图中显示了变化模式（图 3）。随着果实成熟，A和B中苹果酸的积累不断减少。柠檬酸水平在AFS2和BFS3中增加并达到峰值。N-氨基甲酰腐胺在 AF 的任何阶段均未检测到，但在 BFS3 中显著积累。在 S2 和 S3 阶段，丰富的有机酸积累到高水平。

为进一步探讨甜瓜果实基因表达与代谢物积累之间的关系，对AF与BF进行了相关性检验和联合生物学注释。通过结合代谢组学和转录组学数据，作者确定了与糖和有机酸代谢相关的常见改变的 KEGG 途径，并确定了 A 和 B 水果之间的 DEG 和 DAM（图 4）。在所有三个比较组（AFS1 与 BFS1、AFS2 与 BFS2 和 AFS3 与 BFS3）中，“淀粉和蔗糖代谢”和“氨基糖和核苷酸糖代谢”包括更多的 DEG，而“戊糖和葡萄糖醛酸相互转化”（ AFS1 与 BFS1）和“糖酵解/糖异生”（AFS2 与 BFS2 和 AFS3 与 BFS3）是第三丰富的途径。在常见的 KEGG 通路分析中，共发现了 10、20 和 19 个与糖和有机酸代谢相关的 DAM。

Pearson 算法用于计算前 100 个 DEGs 和 DAMs 之间的相关性。从相关性分析的响应强度数据中，发现了与糖和有机酸代谢相关的 DEGs 和 DAMs 的网络分析，并在 AFS2 vs. BFS2 和 AFS3 vs. BFS3 中直观地说明了相互关系（图 5）。AFS2 与 BFS2 中的 DAM，例如蔗糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-(+)-棉子糖、柠檬酸和苹果酸，受到 DEG 的正向或负向调节。

AFS3 与 BFS3 中蔗糖的积累受编码异柠檬酸脱氢酶 (IDH, MELO3C025076.2) 和 ACO1-1 (MELO3C014437.2) 的基因负调控，而 AFS3 与 BFS3 中苹果酸的含量受到正调控通过编码 NADP-ME (MELO3C011129.2)、PDC1 (MELO3C009145.2)、ACO1-1 (MELO3C014437.2) 和 IDH (MELO3C025076.2) 的基因。上述 DEGs 和 DAMs 可能是导致两个甜瓜品种 A 和 B 之间差异的重要因素。

为了分析控制两个甜瓜品种成熟过程的其他因素，发现一些与乙烯信号转导相关的关键基因存在差异表达（表3）。乙烯反应传感器1 ( ERS1 )基因的表达随着AF的成熟而逐渐降低，而随着BF的成熟，其表达先升高后降低，并在BFS2达到峰值。两种乙烯反应性转录因子( ERFs ) 在 AFS1 中的表达高于 BFS1，但在 BFS2 和 BFS3 中高表达。此外，丝裂原活化蛋白激酶 6 ( MPK6) 同源基因在 A 和 B 品种果实成熟时均受到抑制，但在 BFS2-BFS3 中的表达量远高于 AFS2-AFS3。

为了研究类胡萝卜素生物合成的途径，一些类胡萝卜素代谢相关基因被鉴定并在AF和BF之间显著差异表达（表3）。八氢番茄红素合成酶(PSY)基因随着AF成熟持续降低，在BFS2时升高并达到峰值然后降低，此外，类胡萝卜素裂解双加氧酶 (CCD)基因在 A 和 B 中均随着果实成熟而急剧增加。

为了验证作者的 RNA-seq 分析中 unigenes 的相对表达模式，作者选择了 12 个与可溶性糖和有机酸代谢相关的关键 DEG，并在两个东方甜瓜栽培品种果实之间进行了实时定量PCR (qRT-PCR) 表达分析在不同的发展阶段。qRT-PCR 中所有选定基因的表达模式与 RNA-Seq 相似，平均r值为 0.9（r值从 0.73 到 1.00 不等），证实了 RNA-seq 数据的可靠性和后续分析（图 7）。

含糖量和有机酸积累是甜瓜果实品质和口感的重要标准。因此，揭示甜瓜果实糖分积累和有机酸代谢的分子机制具有重要意义。本研究在不同成熟期果实中共检测到961个DAMs，同时还检测到14,703个DEGs。因此，本研究鉴定出的丰富代谢物和DEGs，不仅将为香瓜的高质量遗传改良提供大量信息，而且为葫芦科其他作物提供有价值的参考。

在甜瓜中，蔗糖、葡萄糖和果糖的积累是决定果实品质的主要因素。在本研究中，蔗糖和D-葡萄糖含量明显增加，并在AFS3达到峰值。有机酸在水果营养中起着至关重要的作用，其含量取决于酸合成和降解之间的平衡。中等浓度的有机酸可以增强水果的味道，但高浓度的有机酸往往会降低水果的质量。作者在A和B果实中都检测到了柠檬酸和苹果酸，柠檬酸首先升高在 AFS2 中，然后在 AFS3 中下降，但其含量随着 B 果实成熟而持续增加。这反映了柠檬酸在 B 果实发育中的优势，并可能解释了 A 和 B 果实之间酸的差异。综上所述，丰富多样的糖类和有机酸导致了两个甜瓜品种A和B的不同口味。

两种东方甜瓜品种果实的基因调控改变糖代谢明显不同。两种甜瓜品种果实丙酮酸代谢与三羧酸循环的差异同样显著。根据作者的结果，PEPCK-2的表达上调并在 AFS2 达到峰值；同时，它在 B 果实成熟过程中持续增加，表明与 B 果实相比，A 果实中磷酸烯醇 - 丙酮酸的转化发生得更早。这提供了一个线索，即丙酮酸代谢在 B 果实中可能比在 A 果实中更明显。

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