创新型蛋白质分析技术应用于重组蛋白疫苗研发和质量控制

2022-05-28 04:09:06 ProteinSimple

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全球新冠疫苗管线分布

WHO在5月13日公布的全球新冠疫苗候选物名单中，其中处在临床阶段的疫苗候选物有156个，临床前有198个。其中临床阶段的疫苗候选物有11种，蛋白亚单位（Protein subunit）疫苗，即重组蛋白疫苗的候选个数排在首位，占所有疫苗个数的34%，其次是RNA疫苗、灭活疫苗和非复制型病毒载体疫苗，分别占19%，14%，14%。

临床前研究的疫苗候选物中，蛋白亚单位疫苗占总数39%，RNA疫苗和非复制型病毒载体疫苗占13%，复制型病毒载体疫苗和病毒样颗粒疫苗占10%。

综上，蛋白亚单位疫苗（重组蛋白疫苗）仍然处于新冠疫苗临床和临床前在研的个数最多的疫苗种类。

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重组蛋白疫苗质量控制相关技术

基于重组蛋白疫苗的生产过程，需要对其目标抗原（鉴定、含量、纯度，工艺相关杂质等）、佐剂（佐剂含量、抗原吸附速率、PH等）、最终产品（鉴定、体内外效力、内毒素、PH、无菌试验、异常毒性、工艺相关杂质等）的相关属性进行相关表征和质量控制。疫苗研发相关物理化学和生物化学技术如下表所示。

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ProteinSimple蛋白质分析技术应用于

重组蛋白疫苗研发和质量控制

ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下的蛋白质分析品牌。“使蛋白质分析更简单”是ProteinSimple一直以来的愿景。同时ProteinSimple一直致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫检测技术如数字Western blot和高灵敏微流控多重ELISA。因此在重组蛋白疫苗的研发和质量控制方面，ProteinSimple拥有以下解决方案：

疫苗研发

抗原筛选

高免疫原性蛋白会引起病人产生抗体，病人血清和重组抗原结合信号越强，则可以提示该抗原具有更强的免疫原性，可以用作重组疫苗开发的靶点。结核杆菌膜蛋白是结核杆菌高免疫原性蛋白来源，中国医学科学院病原生物所的科学家重组表达219种结核杆菌膜蛋白作为样本，使用病人血清作为一抗，使用全自动毛细管Digital Western技术进行化学发光定量检测。

克隆筛选

Merck疫苗研发中心使用全自动毛细管Digital Western技术对不同细胞克隆的蛋白表达情况进行对比，通过免疫学反应信号和分子量两个参数进行优质克隆的筛选。

抗原鉴定

同样通过使用全自动毛细管Digital Western技术对多价疫苗抗原进行鉴定。

抗体评价

为提高疫苗的安全性和适用性，美国亚特兰大疾病控制和预防中心的科学家，在热反应性壳聚糖水凝胶中配制了一种狂犬病毒+避孕双重疫苗ERA-2GnRH。该疫苗既诱导了高强度和持久性狂犬病毒中和抗体(rVNA)，同时也诱导了促性腺激素释放激素(GnRH)抗体，并且持续时间更长，体现了疫苗更高和持久的免疫力。使用全自动毛细管Digital Western技术对小鼠产生的抗体进行检测。

制剂开发

Merck疫苗研发中心，利用Maurice-iCIEF全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术，考察冻融及冻融次数对3种不同制剂配方中重组乙肝疫苗稳定性的影响。

堪萨斯州大学药物化学系疫苗分析与配方中心的科学家们致力于非复制型轮状病毒(NRRV)重组疫苗的开发。利用MFI微流成像颗粒分析系统，筛选了35种制药行业常用的赋形剂对P[8]抗原形成聚集体的影响。

辉瑞公司药物研发部的科学家们考察了制剂配方条件对含铝佐剂亚单位疫苗可再悬浮性的影响。通过MFI微流成像颗粒分析系统对颗粒粒径进行分析，研究不同离子强度、pH和抗原浓度，是否会影响颗粒大小和再分散。结果显示，无抗原的磷酸铝佐剂内的颗粒粒径和pH值相关。

细胞免疫检测

mRNA疫苗本身和制造过程中杂质都可诱导先天免疫激活反应，导致细胞先天免疫激活和随之而来的蛋白质表达减少。Moderna公司科学家，采用Ella全自动微流控ELISA技术检测细胞培养上清液和小鼠血清中的INF-β水平，观察mRNA合成过程杂质dsRNA对细胞先天免疫激活的影响。

工艺开发

Merck疫苗研发中心利用全自动毛细管Digital Western技术，定量不同细胞培养条件下的CDTa titer，从而进行细胞培养条件的筛选。

质量控制

上海泽润生物技术有限公司质量研究部，利用Maurice-iCIEF全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术，检测新型人乳头瘤病毒（HPV）治疗性疫苗HPV16E7-HBcAg-Hsp65融合蛋白的等电点。

荷兰转化疫苗研究所利用Maurice-iCIEF全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术，进行不同批次的1型PV（polio vaccine） Mahoney菌株培养的活体脊髓灰质炎病毒电荷异质性分析，评估其批间一致性。

HCP残留是工艺稳定性监测的重要评价指标，是重组疫苗及重组抗体类药物的重要质控指标，ELISA法是各国药典推荐方法。美国FDA推荐值：1-100ppm（ppm：百万分之一），中国药典重组疫苗个论，CHO细胞HCP小于0.05%（相当于小于500ppm）。

2019年8月13日Bio-techne和Cygnus达成全球合作协议，共同基于Ella全自动微流控ELISA技术开发 CHO-HCP 3G Simple Plex ELISA kit。

疫苗中残留的牛血清白蛋白（BSA）通常是疫苗生产中质量控制的重要指标。在分析BSA含量时，重要的是将单体形式与BSA聚集体或降解产物分开，但通过ELISA两者均无法与单体区别开来。Merck疫苗分析开发团队利用全自动毛细管Digital Western技术，开发了一种快速灵敏的检测方法，可专门监控整个疫苗生产过程中以及最终产品中BSA的水平。

稳定性评价

Merck疫苗分析和开发部门利用Maurice-iCIEF全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术，检测乙肝疫苗抗原HBsAg在不同冻融次数下的电荷异质性变化。

Merck公司利用全自动毛细管Digital Western技术，发四价艰难梭分子量谱带。而CDTa和proCDTb则在热应力下非常稳定。因此，毛细管蛋白质印迹通过检测降解和聚集产物可以提供疫苗产品的稳定性信息。

细胞免疫检测

杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队，建立了一种简单快速实验方案，可高效评估接种新冠疫苗和自然感染者全血中T细胞免疫应答。这是一种基于Ella全自动微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定 (CRA) 实验，可快速、简单和准确的对大量人群中的新冠T 细胞进行常规测量。基于Ella平台全血细胞因子释放实验可更精确地评估T细胞在感染新冠（COVID-19）或疫苗接种BNT162b2 BioNtech疫苗：mRNA新冠疫苗）后的保护能力，可与抗体检测互补，有助于确定当前疫苗策略。

体液免疫免测

在很多情况下，病原微生物感染后的血清抗体确证实验是必需和有价值的。美国CDC艾滋病毒、肝炎、性病和结核病国家中心，基于全自动毛细管Digital Western技术，建立HCV血清抗体确证研究全自动化检测平台。

总结

重组蛋白疫苗已逐渐成为中国疫苗研发的重要品类，但疫苗研发和质量控制方面相关原则还在逐渐完善中，需要对各种关键质量属性进行更多研究和分析开发。ProteinSimple为您提供一系列创新型蛋白质分析技术，在抗原鉴定、制剂开发、工艺和产品制剂杂质等方面革新疫苗研究和治疗分析方法。

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关于我们

ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。

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参考文献：

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COVID-19 vaccines: progress and understanding on quality control and evaluation.
https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines.
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Applications of an Automated and Quantitative CE-Based Size and Charge Western Blot for Therapeutic Proteins and Vaccines.
Inactivated Rabies Virus-Vectored Immunocontraceptive Vaccine in a Thermo-Responsive Hydrogel Induces High and Persistent Antibodies against Rabies, but Insufficient Antibodies against Gonadotropin-Releasing Hormone for Contraception.
Development of Imaged CapIllary Isoelectric Focusing (iCIEF) method and Use of CapIllary Zone Electrophoresis (CZE) in Hepatitis B Vaccine (RECOMBIVAX HB®).
Characterizing and Minimizing Aggregation and Particle Formation of Three Recombinant Fusion-Protein Bulk Antigens for Use in a Candidate Trivalent Rotavirus Vaccine.
Impact of Formulation and Suspension Properties on Redispersion of Aluminum-Adjuvanted Vaccines.
Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation.
Characterization and evaluation of the immune responses elicited by a novel human papIllomavirus (HPV) therapeutic vaccine: HPV16E7-HBcAg-Hsp65 fusion protein.
Isoelectric point determination of live polioviruses by capIllary isoelectric focusing with whole column imaging detection.
Residual bovine serum albumin (BSA) quantitation in vaccines using automated Capillary Western technology.
Rapid determination of the wide dynamic range of SARS‐CoV‐2 Spike 1 T cell responses in whole blood of vaccinated and naturally infected.
An Automated Immunoblot Method for Detection of IgG Antibodies to Hepatitis C Virus: a Potential Supplemental Antibody Confirmatory Assay.