实用！动物实验专题——AAV如何实现精准靶向感染（心血管研究必收藏）

2020年9月11日，国家心血管病中心发布了《中国心血管病健康和疾病报告2019》，报告显示中国心血管病现患人数3.3亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺原性心脏病500万，心力衰竭890万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，下肢动脉疾病4530万，高血压2.45亿。《报告》显示，中国心血管病患病率处于持续上升阶段，心血管疾病仍是造成死亡的重要因素。

心血管研究一直是生命科学和医学中的热点方向。吉凯始终助力临床医生在心血管疾病上的转化研究，产品/服务曾登顶多个顶级期刊如，Nature Medicine、Circulation、Cell Metabolism、Journal of Extracellular Vesicles、Circulation Research、Journal of Pineal Research、Nature Communications、Leukemia、Blood等。（了解最新心血管领域文献，请点此查阅）

今天小编邀请大家一起学习AAV在心血管系统研究中的基因转导及组织特异性表达策略。

现有研究当中AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9型均有应用于心脏方向的研究，有文献报道^[1]，一周龄小鼠通过系统性的注射方式（颈静脉注射）不同血清型、不同病毒总量AAV，四周后检测感染心肌细胞感染情况，结果表明，AAV8和AAV9对心脏的感染效率高于其他血清型：

图1. 不同血清型、不同剂量AAV感染小鼠心脏表达情况对比^[1]

常规2型启动子在心脏中已有较好的表达，表达效果已经可以满足大多数实验需求，如果没有组织特异性感染的要求，可以选择CMV启动子：

图2. 吉凯客户文献^[2]:Circular RNA CircMAP3K5 acts as a microRNA-22-3p sponge to  promote resolution of intimal hyperplasia via TET2-mediated SMC differentiation（IF=29.690）

如果需要实现目的基因在心脏中的特异性表达，需构建装载特异性启动子或使用组织特异性血清型的AAV以实现目的基因在心脏或者血管中的特异性表达，比较常见的有心肌细胞特异性启动子cTNT以实现心肌细胞的特异性表达、血管内皮细胞特异性启动子Tie2以实现内皮细胞的特异性表达，具体如下。

使用心肌细胞特异性启动子cTNT，可以突破注射方式的局限，即使使用简便的系统性注射方式，也可以实现心肌细胞的特异性表达，以如下颈静脉注射方式为例，装载有cTNT启动子的AAV可以实现心肌细胞的特异性感染，并且在其他器官中，未检测到目的基因的表达。

图3. 吉凯客户文献^[3]:Ischemic Heart-Derived Small Extracellular Vesicles Impair Adipocyte Function（IF=17.367）

为了实现内皮特异性，我们主要通过组织特异性血清型和内皮特异性启动子两个方面实现：

(一) 内皮特异性血清型：sig和ENT

1. sig血清型：是在2型的AAV上插入了EC靶向肽SIGYPLP；

2. 内皮高转导血清型ENT：是通过AAV9衣壳A589位点插入一个七肽SLRSPPS，使其对内皮细胞的感染效率显著增高。

(二) 内皮特异性启动子：TIE和ICAM2

其实不管是选择组织特异性血清型或者组织特异性启动子，所呈现的特异性其实也不是绝对的，只是增加内皮细胞的感染效果，组织特异性血清型使用的同时，也可以同时选择组织特异性启动子。

1. ICAM2启动子

人细胞间粘附分子2（ICAM-2）表达局限于血管内皮细胞和巨核细胞，Cowan6鉴定了该基因0.3k的启动子，并验证了其内皮细胞特异性。

2. TIE启动子

另外一种内皮特异性启动子来源于酪氨酸激酶受体TIE1/2基因，与ICAM-2调控原理类似，在内皮的特异性主要由PEA3基序决定。

以TIE2启动子为例，通过尾静脉注射的方式，可以实现血管内皮细胞的特异性感染，下图为动脉粥样硬化Apoe−/−小鼠模型中注射TIE2血管内皮细胞特异性AAV，通过免疫组化及westernblot检测各组主动脉内皮细胞Bcl-2蛋白水平，并用β-肌动蛋白定量，实验结果如下图所示：

图7. 吉凯客户文献^[7]:NRP2 promotes atherosclerosis by upregulating PARP1 expression and enhancing low shear stress-induced  endothelial cell apoptosis

心血管主要有心脏和血管组成，在使用工具病毒感染心脏或血管时常用的注射方法主要有尾静脉注射、心肌定点注射、心包内注射、血管夹闭注射等，具体操作方法介绍如下：

1.实验前准备

准备内容：常规手术器械、静脉留置针、气官插管、10ml注射器、缝合线、剃毛器、呼吸机、体重秤、微量注射器、干棉球、1%的戊巴比妥、胰岛素注射针、小鼠、病毒、碘伏、75%酒精、金霉素眼膏、PBS。

a. 麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5~10 min；

b. 固定：待小鼠完全麻醉后，将其固定在操作台面，用门齿环固定头部，眼部涂抹金霉素眼膏以保持湿润；

2.心脏暴露及固定

a. 使用镊子将小鼠舌头拉出，然后用耳镜找到声带，并引导导丝通过声带进入气管，而后在导丝的引导下将导管置入气管内；

b. 抽出导丝，利用10ml注射器吹气观察肺部变化，确定插管放置位置准确，而后用缝合线将导管固定；

c. 使小鼠处于左侧卧位，将气管内插管与呼吸机连通；

d. 剔除胸部偏左部位的毛发，用酒精和碘伏依次消毒，盖上手术布，确保手术部位无菌；

e. 在第四肋间隙做一个2厘米的皮肤切口，分割皮下组织和肌肉肌肉，通过第四肋间隙进入胸腔，观察左膈神经，在不破坏神经的情况下打开心包，露出左心室；

3. 病毒注射

a. 穿过左心室尖端放置一根7–0聚乙烯缝合线，并用一对止血钳夹住缝合线的两端；

b. 用胰岛素注射针吸取适量病毒载体，用优势手拿胰岛素注射器；

c. 用非优势手抓住缝合线操控心脏位置，使得最大程度暴露左心室注射位点；

d. 将胰岛素注射器针头插入心肌，回抽确认无回血后注射适量病毒，然后依次注射其它位点（一般3~5个位点，保持位点间距相等，每个位点注射量约5μl）；

e. 注射结束后，将18号的静脉留置针穿过皮肤并经第五和第六肋间隙进入胸腔，抽出针头。

4. 动物复苏

a. 依次缝合肋间隙、肌肉组织、皮下组织、皮肤；

b. 皮肤缝合后，将静脉留置针与10ml注射器相连，拉出活塞至拉动受阻，保持活塞位置，将静脉留置针和注射器移走；

c. 待小鼠恢复自主呼吸后，关闭呼吸机撤掉气管内插管，并将大鼠从操作台上取下放入饲养笼内（可在旁边放置电暖器），待其苏醒。

注意事项：

a. 手术后4h和12h注射消炎止痛药，防止动物因疼痛而抓挠伤口致使开线或伤口感染。

b. 病毒种类不同，其感染扩散范围不同，要根据注射病毒类型选择合适的注射位点数。

图8.心包结构示意图

1. 实验前准备

准备内容：新生鼠、250ul注射器、33号针头、微套管（内径0.51mm，外径1.53mm）、病毒、冰、无菌生理盐水或PBS、培养皿

a.  装置准备：在33号针头上距尖端3mm位置以上位置用微套管覆盖；

b.  麻醉：将幼鼠从笼内取出，放入培养皿后置于冰上2~3min，使其麻醉；

2.病毒注射

a. 吸取病毒：用微量注射器吸取足量的病毒，而后更换准备好的33号针头并轻推排出气体，放冰上备用；

b. 抓取幼鼠：用非惯用手的拇指和食指捏住幼鼠颈背部皮肤，翻转手腕使幼鼠腹部朝上，确保能清晰看到胸骨、肋骨和剑突；

c. 注射：用惯用手持微量注射器，自左肋骨剑突角下针，而后将针头向上沿与左肋骨边缘平行方向推进3mm（至套管处）停止，缓慢注射50μl病毒液至心包腔，而后缓慢将针拔出；

3. 动物复苏

将幼鼠放回原鼠笼母鼠身边，采取适当保暖措施帮助小鼠恢复。

注意事项：

a. 病毒注射时进针操作要轻柔，避免用力过大损伤幼鼠其它脏器或进针过深；

b. 病毒注射完毕，必须要立即采取保暖措施，确保幼鼠体温快速恢复。

图9. 血管夹闭示意图

1. 实验前准备

准备内容：小鼠、常规手术器械、缝合线、剃毛器、体重秤、微量注射器、干棉球、1%的戊巴比妥、胰岛素注射针、碘伏、75%酒精、双氧水、金霉素眼膏、PBS。

a. 麻醉：小鼠称重后腹腔注射1%的戊巴比妥（剂量为80mg/kg体重），放置于饲养笼内，约5~10 min；

b. 固定：待小鼠完全麻醉后，将其固定在操作台面，用门齿环固定头部，眼部涂抹金霉素眼膏以保持湿润。

2. 血管暴露

a. 将大鼠头适当向右偏转；

b. 用剃毛器将大鼠左侧颈部毛发剔除，用酒精、碘伏、双氧水依次擦拭皮肤消毒；

c. 在颈部偏左位置做一个3cm切口，分离皮下组织、肌肉等，用止血钳拉开皮肤，暴露出左侧颈动脉。

3. 病毒注射

a. 确定好感染目标节段，分别在其远心端和近心端各夹一个止血夹（根据流向先夹上游），确保血流完全阻滞；

b. 用胰岛素注射针吸取适量病毒（约50μl），而后将病毒缓缓注入夹闭的血管节段，30分钟后拿掉止血夹，恢复血液流通；

4. 动物复苏

a. 先使用可吸收的4-0缝合线缝合肌肉，然后用5-0缝合线依次缝合皮下组织和皮肤；

b. 将小鼠放回笼内（可在旁边放置加热器），待其苏醒。 

注意事项：

a. 手术后4h和12h注射消炎止痛药，防止动物因疼痛而抓挠伤口致使开线或伤口感染；

b. 血管夹闭时间越长病毒感染效果越好，但对下游组织的损伤也越严重，因此夹闭时间不宜超过半小时。

最后，对以上注射方法特性总结如下表：

【参考文献】

[1] Prasad K ,  Xu Y ,  Yang Z , et al. Robust Cardiomyocyte-Specific Gene Expression Following Systemic Injection of AAV: In Vivo Gene Delivery Follows a Poisson Distribution[J]. Gene Therapy, 2011, 18(1):43-52.

[2] Zeng Z ,  Xia L ,  Fan S , et al. Circular RNA CircMAP3K5 Acts as a MicroRNA-22-3p Sponge to Promote Resolution of Intimal Hyperplasia via TET2-Mediated SMC Differentiation[J]. Circulation, 2020, 143(4).

[3] DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320157

[4] Chen S ,  Kapturczak M ,  Loiler S A , et al. Efficient transduction of vascular endothelial cells with recombinant adeno-associated virus serotype 1 and 5 vectors.[J]. Human Gene Therapy, 2005, 16(2):235.

[5] Nicklin S A ,  Buening H ,  Dishart K L , et al. Efficient and selective AAV2-mediated gene transfer directed to human vascular endothelial cells[J]. Molecular Therapy, 2001, 4(3):174-181.

[6] Varadi K ,  Michelfelder S ,  Korff T , et al. Novel random peptide libraries displayed on AAV serotype 9 for selection of endothelial cell-directed gene transfer vectors.[J]. Gene Therapy, 2012, 19(8):800-809.