你问我答（002）：为什么梯度洗脱中只增加柱长，分离度并没有增加？

问：为什么梯度洗脱中只增加柱长，其他条件不变时，分离度并没有增加？

答：首先我们来讨论一下什么时候要选择梯度洗脱。我们知道色谱分离的保留因子k值一般在1和10之间是最适合的，对于具体的方法开发中，我们也可以把这个首选的保留因子范围扩大到0.5~20。当k太小时，容易受到样品辅料或者其他非分析（"垃圾峰"）色谱峰的干扰，而当k太大时，较晚洗脱出的峰形较宽，因此峰高不足，灵敏度降低。假如发现在k的某个最大范围（0.5~20）内依然不能容纳所有的目标峰，我们就有必要使用梯度洗脱。这在我们前面的文章中有具体讨论（梯度or等度，that is a question）。

根据等度洗脱的经验，当增加柱长时，等度洗脱的保留时间、峰宽和分离度通常会显著增加。然而梯度洗脱却不太一样，例如在梯度洗脱中，随着柱长的增加（同时保持其他条件固定），分离度却没有增大，甚至有时会轻微降低，这让我们感到困惑，这是为什么呢？

首先我们来看几个基本的概念和公式：

梯度洗脱的保留因子k*，是指溶质峰流过色谱柱中点时的k。

其中，b为梯度斜度（gradient steepness）：

t_G：梯度时间

F：流速

V_m：色谱柱死体积，V_m=5×10^-4 Ld_c²（L和d_c单位为mm）

∆φ：梯度范围

S：化合物的常数，对于小分子（100~500Da），S≈4

当柱长增加时，柱子的死体积V_m增加，那么k*会减小，从而使分离度减小。另一方面，柱长增加通常会使得柱效N*增加，从而增加分离度，但也只能部分补偿由于k*减小而引起的的分离度的减小。如下面的分离度公式所示。综合效果来讲，当只改变柱长，而其他条件保持不变时，分离度基本保持不变。

图1为“规则（regular）”样品在仅改变柱长时的色谱图，可以看到增加柱长时，柱效随之增加，但是第一个和第二个峰的分离度反而逐渐稍微降低。

图1 “规则（regular）”样品仅改变柱长的色谱图（Conditions: 0–100 percent B in 15 min; methanol (B)–water (A) mobile phase; C18 column (5 mm particles); 2.0 mL/min; 30 ℃; (a) 50 × 4.6 mm column; (b) 150 × 4.6 mm column; (c) 250 × 4.6 mm column）

对于“非规则（irregular）”样品的梯度分离，当单独改变柱长时，分离度也基本不变。然而，由于柱长的增加会导致k*的降低，因此某些不规则峰的相对保留和临界分离度（critical resolution）会有所不同。如图2所示，峰3和9在色谱图中的相对位置随着柱长的变化而改变，当使用较短的色谱柱时，某些峰对（例如 3 和 4）分离度更好。

图2 “非规则（irregular）”样品，仅改变柱长时的色谱图（Conditions: 5–100 percent B in 15 min(acetonitrile–buffer mobile phase); 43 ℃; 2.0 mL/min; C18 column (5 mm particles); (a) 50 × 4.6 mm column; (b) 150 × 4.6 mm column; (c) 250 × 4.6 mm column. ）

总结来看，作为提高分离度和减少分析时间的一种手段，改变柱长在梯度洗脱中往往是值得的，但在具体的方法开发的过程中，此类改变应在其他条件（如最佳 k* 和 b）选定后再进行。而且当柱长改变时，为了不改变之前优化好的选择性α，梯度时间应该同时改变以保持k*的恒定。

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参考文献

Snyder L R, Dolan J W. High-Performance Gradient Elution: the Practical Application of the Linear-Solvent-Strength Model [M]. John Wiley & Sons, 2007.