色谱模拟技术在小分子与大分子药物方法开发的应用

首先，Gioacchino比较了市场上销售量前200的药物，发现从2006到2021年间，生物药的占比从10%上升到了43%。生物药的明显特征是其结构的复杂性比小分子药物要高很多，为了建立能够有效表征和分析生物药的分析技术，其结构的复杂性往往会转化为建立分析方法过程的复杂性。随着各制药公司纷纷涉足生物药领域，该问题日益凸显。

随之而来的问题就是，作为分析科学家该如何应对日益增加的样品复杂性？

Merck分析团队认为解决这个问题最好的策略仍然还是色谱分离技术，但不仅仅局限于反相色谱法。为了解决样品复杂性带来的分析难度，Merck的分析科学家们不再仅仅依靠反相色谱法，而是尝试了不同的色谱分离技术如SFC, IEX, SEC等。而然，如果要同时考虑这么多不同技术的使用，我们可以想象分析方法开发将变得难以置信的复杂和具有挑战性。那有没有方法可以简化这么复杂的方法开发过程呢？

答案是肯定的。Merck的分析团队常用的策略就是筛选加优化的组合。第一步，利用自动化的筛选平台，筛选出最合适的色谱柱和流动相体系；接着，利用色谱模拟技术对筛选的方法进一步优化。Gioacchino说：“我们开始越来越多地依赖于建模工具的使用，以显著减少我们需要完成的实验数量，以便快速识别出最佳组合，从而给出最终的分离。” Gioacchino接说：“我们开始时处理的是很复杂的东西，希望在结束时，一旦我们有了最终的方法，我们就有了简单易用的东西。”

Gioacchino分享了两个他们实验室自动化筛选加色谱优化的案例。第一个案例是利用多柱IEX筛选系统结合ACD/Labs LC-Simulator色谱模拟软件用于建立大分子药物分析和纯化方法的建立；第二个案例是多柱筛选平台加ACD/Labs LC-Simulator色谱模拟软件用于小分子药物手性方法的开发及手性的拆分。

案例一：离子色谱筛选系统与计算机建模结合用于生物药方法的开发与优化

超高效液相色谱的柱筛平台的配置如下图所示，在通道A和通道B下均配置了12路的流动相切换阀，还配有12路的色谱柱切换系统，共可一次性筛选24种不同流动相和12根不同的色谱柱。在检测器上配置了UV和荧光检测器，并配有组分收集模块。

接着选用3组不同的样品对该分析方法开发工作流进行了测试，这三组样品分别为核酸，多肽和蛋白质样品，结构信息如下图所示。

每组样品溶液共筛了12根色谱柱和8种不同的流动相，共96针实验，3组样品共288针实验。正是有了柱筛平台，这些实验才能一次性连续跑完。最后对所有筛选的结果以分离度为关键指标进行了统计。红色代表有组分共流，深绿色代表分离度都大于1。每个样品的最佳谱图如下图所示，其中2号多肽样品的分离度还有待于进一步提高。

接着，在方法优化阶段，利用ACD/LC-Simulator构建了梯度，温度和pH的三因素实验，很好的解决了多肽样品的分离问题。

利用多柱筛选加组分收集硬件和LC-Simulator建模软件，Merck团队成功的将该平台用于多肽类杂质组分的纯化。

案例二：高效手性筛选联用计算机建模技术快速开发手性方法

对映体的色谱拆分是学术界和工业界的公认难题， 超临界色谱法现在已经成为这种分离的黄金标准。但受限于仪器和分析人员的技术，建立SFC方法的可转移性低。分析科学家们更习惯于液相色谱法的分离。因此Gioacchino团队介绍了RPC手性方法开发平台，这个平台的的筛选部分有14根色谱柱（包括2微米直径的全多孔色谱柱FPP以及3微米的表面多孔色谱柱）以及9种流动相供选择，包含反相，Hilic，Polar-Organic模式，Polar-ionic 模式等多种作用模式。

接着，选用18种不同的标准品对该平台进行测试，用自动化筛选平台跑完35种不同色谱柱和流动相组合仅用了6小时。样品结构和筛选结果如下图所示，绿色代表分离度大于1.5，红色代表分离度小于0.5，黄色代表分离度在0.5-1.5之间。带星号者被认为是最佳的方法。显然某些方法对多个手性化合物的分离都有效；某些色谱柱的对某个化合物的分离可以跨越流动相的种类。

接着，仍然是借助ACD/ LC-Simulator 对筛选找到的方法进一步优化。此自动化筛选结合色谱模拟技术的手性方法开发平台，可以对色谱柱和流动相的所有可能组合进行全面评估，尤其是对于具有挑战性的对映体的分离。此外，UHPLC筛选平台可以让色谱条件的趋势可视化，从而快速识别有效分离对映体所需的最佳分析条件，同时也为快节奏对映体纯度分析的精简发展奠定了基础。

最后Gioacchino介绍了如何利用自动化筛选拼平台加色谱模拟软件的优化流程，建立一个通用的、可持续的、易操作的色谱柱性能评估方法，续性监控色谱柱的稳定性和选择性。详细内容可观看视频或参见计算机辅助建立通用RPLC色谱柱性能评估方法一文。