Front. Med. | “千挑万选”单细胞蛋白质组学如何分析正常肾脏近端肾小管和肾小球？

2020年9月，加州大学的Minnie M. Sarwal课题组在Frontiers in Medicine发表的题为“Near-Single-Cell Proteomics Profiling of the Proximal Tubular and Glomerulus of the Normal Human Kidney”的研究成果，通过单细胞蛋白组学研究方法，分析正常人近端肾小管和肾小球区域的肾脏细胞，研究为解开急性和慢性肾脏疾病病因和肾脏亚细胞功能扰动提供依据。

单细胞转录的分析可以揭示临床组织的细胞群差别，有助于了解肾脏生物学和分子功能，但基于单细胞蛋白组分析的方法需求尚未得到满足。与基因组学不同，蛋白组学技术可以提供细胞状态和调控的功能信息，在本研究中探究了单细胞蛋白组学方法，该方法实现了高灵敏度的蛋白组学检测。作者处理11个人体肾脏组织，通过µPOTS 收集、处理样本的蛋白组学表达，与高灵敏度的LC-MS/MS 结合使用，建立了一种自动化的 µPOTS 方法，实现了10~100个激光捕获显微切割（LCM）肾细胞中约3000种蛋白的定性和定量。该技术有助于揭示疾病的发病机制和独特的蛋白标志物，并有助于进一步探讨预后和不同肾脏疾病亚型中的蛋白组学异质性。

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1. 实验样本：人体肾脏组织（肾小球和近端小管，n=11）

2. 实验分组

（1） FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）+OCT组（n=2）

（2） OCT组（n=9）

3. 切片厚度：一个 5 μm（ H&E 染色） 和三个 10 μm 厚的连续切片

4. 质谱仪：Orbitrap Q Exactive HF-X (Thermo Scientific) 

5. 搜库软件：MaxQuant

对于相同数量的组织，OCT冷冻肾脏比来自同一肾脏的FFPE切片得到更多的蛋白质，表明尽管组织包埋在石蜡切片中不到2个月，但FFPE中的蛋白质有可能被降解。两个人肾脏的蛋白质组学数据显示，两个OCT肾脏之间鉴定的蛋白质有84%重叠，83%的蛋白质在两个FFPE肾脏之间重叠(图1B)。为评估不同收集方法之间的蛋白质丰度，发现OCT组织蛋白质组学产生了更多具有高光谱计数≥5的蛋白质，反映了OCT肾脏组织可能得到更好保存(图1C)。OCT组织的蛋白质组学分析也比FFPE组织采样到更多独特的蛋白质(图1D)。不考虑组织保存方法，在常见的生物途径中也有很强的重叠，这些途径包括小分子代谢过程、羧酸代谢过程、有机酸的代谢过程和药物代谢过程。这一数据突显了肾脏组织的蛋白质组学，无论在两种测试方法的如何保存组织，检测结果都是高度重复的。

在用单细胞蛋白质组学处理的9个正常人类肾脏中，平均每个肾小球（GLOM）/近端肾小管（PT）部分有10-40个细胞输入，平均每个样本鉴定出有2,560个蛋白质。很多的结构肾脏蛋白不是特异性的，在两个亚室的直接比较中，208个蛋白质在GLOM中富含，67个蛋白质在GLOM中独特存在(在PT中缺失)；247个蛋白质在PT中富含，25个蛋白质在PT中独特存在(在GLOM中缺失)。

进行交叉批次验证，尽管这些数据来自不同的正常肾脏队列(图2A)，即使有一小部分独特的肾脏(第一批中有两个，第二批中有四个)，210个Glom丰富的蛋白质也在两个独立的组之间高度相关，并在不同的时间进行了分析。246个PT丰富的蛋白也可以在两个不同的正常肾脏队列中相关(图2B)。结果表明，单细胞蛋白质组学能够重复地识别肾脏不同单位保守的亚室特异性蛋白质。

图3A，B表示了那些未被IHC检测到的蛋白质(标记有∗)或无法获得的数据(标记有∗∗)。作者取了前26个GLOM丰富的蛋白质和26个PT特异蛋白质，并通过了单细胞转录数据(scRNA序列数据)进行“交叉组学”整合和验证(图3B)。通过蛋白质组学和转录组学对Glom和PT标记进行综合分析的结果表明，一些已知的Glom和PT标记蛋白具有很强的相关性。除了验证已知的标记蛋白，单细胞蛋白组学还识别了在转录数据集中或IHC数据集中发现的低丰度蛋白质。例如，单细胞蛋白质组学数据中的PITPNB是一种高度浓缩的肾小球标志物；然而，该基因在转录数据中的检测率较低，并且无法被IHC检测到。SLC5A1的信号在单细胞蛋白质组学数据中得到增强，但在转录或IHC数据集中没有增强(图3C)。

作者使用通过单细胞蛋白组学产生的数据来观察在肾小球细胞或近端肾小管中显著丰富的蛋白质细胞。208个Glom富集区蛋白富含囊泡中间运输和细胞成分组织调节作为其最重要的生物学过程，细胞骨架蛋白结合和肌动蛋白结合是最重要的分子功能，肌动蛋白细胞骨架是最丰富的细胞成分。富含247个PT的蛋白质主要集中在小分子代谢过程和药物代谢过程中。在最重要的分子功能中，这些蛋白质的氧化还原酶活性和催化活性丰富。

除了GLOM或PT切片中的富集蛋白外，92种蛋白是GLOM(n=67)或PT(n=25)所特有的，只在肾小球细胞或近端肾小管细胞中发现。仅在肾小球细胞中发现的蛋白质具有丰富的分子功能，如肌动蛋白结合、细胞骨架蛋白结合等。仅在GLOM切片中发现的67种蛋白质中，有41种已被报导存在于肾脏中，在这41种蛋白质中，18种(43.9%)与单细胞蛋白组学结果一致，23种(56.1%)在GLOM中与小管相比没有增加。

仅在PT切片中发现的25种蛋白质中，有20种已被报告存在于肾脏中。这些蛋白质具有丰富的分子功能，如羧酸转运蛋白活性、溶质：钠转运蛋白活性等。在25个PT特异性蛋白质中，19个蛋白质亚集(95.0%)与单细胞蛋白组学结果一致，只有1个(5.0%)在小管中与GLOM相比没有增加。

此研究构建了可应用于肾脏疾病样本的单细胞蛋白质组学方法，有利于了解不同肾脏亚室中的蛋白质变化，这些蛋白质在肾脏疾病中的差异调节可以揭示肾小球与肾小管疾病表型的临床和预后异质性，有利于揭示肾脏损伤与恢复的新诱因，其中在肾脏特定区域发现的新途径可以为药物治疗提供重要靶点依据。

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END

房角石|撰文

小久|排版

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