GUT | 单细胞转录+代谢组学：台湾辅仁大学陆嘉真团队发现肠道微生物群能调节慢性阻塞性肺病发病机制

2021年9月，台北辅仁大学陆嘉真团队在Gut发表的题为 “Gut microbiota modulates COPD pathogenesis: role of anti-inflammatory Parabacteroides goldsteinii lipopolysaccharide” 的研究成果，本研究通过小鼠吸烟（CS）的慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型构建，评估肠道微生物群在COPD发展中的因果关系，另外采用单细胞RNA测序、血清代谢组学以及16S rRNA测序分析发现，肠道菌群组成显著影响CS诱导的COPD发育，存在肠道菌群-肺COPD轴。金氏拟杆菌（Parabacteroides goldsteinii）能改善COPD，降低肠道炎症，增强结肠线粒体和核糖体活性，系统地恢复血清中异常宿主氨基酸代谢，以及抑制肺部炎症。

慢性阻塞性肺病（COPD）是一种全球性的疾病，其特点是肺部气流的慢性阻塞干扰了正常呼吸。尽管有报道发现呼吸道的微生物群与慢性阻塞性肺病有关，但肠道微生物群在慢性阻塞性肺病发展中的因果关系还没有确定。因此作者研究了肠道微生物群组成和肺部COPD发展之间的联系，并描述细菌及其衍生的活性成分对COPD的改善情况。

1、实验样本：小鼠（6-8周龄）

2、实验分组：CTL（对照组），CS（吸烟模型组），ABX（抗生素处理组），NEO（新霉素处理组），AMP（氨苄青霉素处理组），WAN（万古霉素），CS+Pg（金氏拟杆菌处理组）

随后作者从ABX处理的粪便微生物群样本中分离出一株Pg菌株MTS01。Pg MTS01的16S rRNA基因测序显示与Pg JCM13446的基因有99.9%的一致性。口服Pg MTS01的小鼠体重明显增加并改善COPD表型（图3A-J）。在结肠中，Pg MTS01治疗减少了促炎症细胞因子如IL-1β和TNF-α的表达，并增加了CS小鼠ZO-1和Occludin的表达。Pg MTS01进一步恢复了在Caco-2-细胞体外模型中TNF-α诱导的细胞层通透性。分析Pg MTS01对体重变化、肺部和肝脏的组织病理学、血清GPT和BUN水平的影响，结果表明Pg MTS01对健康小鼠没有不良影响。

为了进一步确定Pg MTS01对结肠细胞生理学影响，作者对经过或未经过Pg MTS01处理的CS小鼠的结肠组织衍生细胞进行了单细胞RNA测序（scRNAseq）和分析（图4A、B）。与CTL小鼠相比，CS小鼠的脂肪酸代谢、二十烷烃代谢、膜微血管形成和内肽酶活性的基因表达增加，而涉及核糖体生物生成和线粒体活性的基因表达减少。

相比之下，Pg MTS01给药后，CS小鼠的细胞抗氧化剂、氧化还原过程、抗菌剂、线粒体去极化、核糖体活性和粘蛋白产生等基因明显上调（图4C、D）。Mptx1、Ang4和Muc2、RNR1、RNR2、Cytb、PGC-1α、ND-5和线粒体编码的转录因子A基因的表达水平与氧化应激和核糖体或线粒体活动有关，结果通过qPCR进一步验证。

相比之下，Pg MTS01对CS小鼠的任何GO途径都没有明显的下调。随后作者分别测量了与氧化磷酸化和非线粒体糖酵解功能有关的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR），结果证明Pg MTS01增加了CS小鼠的异常OCR活动，并降低了ECAR。因此，推测Pg MTS01有减少炎症的功能，并可以恢复CS小鼠结肠中被废除的细胞核糖体和线粒体活性。

口服Pg MTS01改善COPD肺部发病机制的现象可能与恢复血液中的系统异常代谢有关。为了进一步确定小鼠血清中的代谢组学是否受到Pg MTS01治疗的影响，作者进行了非靶代谢分析。对血清代谢物的代谢通路分析，发现Pg MTS01治疗最明显地改善了CS小鼠的异常氨基酸相关代谢途径，包括增加瓜氨酸和脯氨酸的生物合成，苯丙氨酸和甘氨酸的降解等。因此，推测Pg MTS01可能增强与细胞核糖体、线粒体活动以及尿素循环周转有关的氨基酸代谢。

进一步的肺组织单细胞RNA测序分析表明，CS增加了B细胞和巨噬细胞的存活数，并减少了T细胞和中性粒细胞的数量，而这些改变都能被Pg MTS01的给药所逆转（图4E，F）。此外，Pg MTS01明显恢复了CS小鼠中发现的异常基因表达模式。相比之下，涉及抗氧化活性、二十烷烃结合活性、脂肪酸合成和免疫反应的基因被上调（图4G-I）。然而，Pg MTS01没有明显降低CS小鼠的血清IgG水平。简而言之，Pg MTS01减少了过度炎症免疫反应，包括那些与肺组织中B细胞受体信号有关的反应。

对Pg MTS01的全基因组序列进行BLAST分析（图5C），发现参与脂质A合成的基因与Bacteroides dorei和Bacteroides thetaiotaomicron中的基因相似（图5D，E）。相对于肠道细菌分离出的促炎性脂多糖（LPS），Bacteroides衍生的LPS亚型表现出明显较低的内毒素和免疫刺激反应。为了了解Pg MTS01和大肠杆菌是否表现出亚型特异性LPS免疫原性的差异，作者测定了它们对细胞活化的影响。结果发现Pg-LPS显示出对EC-LPS活性的拮抗作用。

随后，作者研究了Pg-LPS在改善CS-诱导的COPD发病机制方面的潜力。由于腹腔内（i.p.）施用促炎性LPS会促进COPD的肺气肿发展，于是作者测试了Pg-LPS对CS小鼠的i.p.处理效果，对COPD进行表型分析。与CS小鼠相反，Pg-LPS治疗在低剂量和高剂量下分别使体重增加18%和13.9%（图6A，B），减少BALF细胞浸润（图6C），并使肺部病理学和功能正常化（图6D-I）。此外，Pg-LPS减少了COPD小鼠肺组织（图6J，K）和结肠（图6L，M）中促炎症细胞因子的过度表达，如IL-1β和TNF-α。同时，COPD小鼠支气管肺泡灌洗液（图6N）和血清（图6O）中增加的LPS浓度和活性都被Pg-LPS显著降低。进一步的研究表明，用Pg-LPS处理的对照组小鼠的肝脏和肾脏功能正常。因此，推测Pg MTS01来源的LPS改善了CS诱导的小鼠COPD。

肠道微生物群组成显著影响CS诱导的COPD发展，粪便微生物群移植后可改善COPD。分离出的共生细菌金氏拟杆菌，在减少肠道炎症和增强结肠中的细胞线粒体和核糖体活性方面发挥重要作用，能够系统地恢复血清中异常的宿主氨基酸代谢以及抑制肺部炎症。研究证明Pg MTS01和Pg-LPS可能是改善COPD的潜在治疗药物。

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