敢为人“酰” | 卢克锋研究员课题组首次报道蛋白N端乙酰化酶Nat3在自噬调控中的作用

2022-03-04 04:16:44, PTMab 杭州景杰生物科技股份有限公司

蛋白N端乙酰化 (N-terminal acetylation，Nt-乙酰化) 是真核生物中最常见的修饰之一。与赖氨酸乙酰化不同，Nt-乙酰化将乙酰基转移到蛋白质的N末端，即蛋白质中第一个残基的氨基。蛋白Nt-乙酰化通过N端乙酰转移酶 (NAT) 实现，乙酰辅酶A (Ac-CoA) 是其供体。蛋白Nt-乙酰化与蛋白的稳定性和膜结合有关，但该修饰参与的细胞信号通路和具体的分子调控机制仍不十分清楚。

近期，四川大学卢克锋研究员课题组在Cell Reports上发表题为“Function and molecular mechanism of N-terminal acetylation in autophagy”的研究成果。该研究以酵母为研究材料，发现蛋白Nt-乙酰化酶Nat3在自噬过程中发挥重要作用，它通过Nt-乙酰化肌动蛋白细胞骨架组分Act1和dynamin-like GTPase Vps1，分别调节Atg9囊泡的转运和自噬小体与液泡的融合。


作者首先通过酵母筛库，鉴定到一个新的自噬调控因子Nat3。Nat3是一个Nt-乙酰转移酶 (含GCNT结构域) ，可乙酰化蛋白质的第一个Met残基 (序列以M-D/E/N/Q开头) 。Nat3缺失将导致自噬过程完全受阻，产生类似于atg6突变体的表型。进一步研究发现，Nat3突变后，自噬底物Ape1将不能进入液泡并在液泡外的细胞质中聚集，自噬小体标志物ATG8也在胞质中扩散，添加Nat3能回补这种现象。这些证据表明Nat3参与调控自噬体的形成。Nat3的Nt-乙酰转移酶活力对于它在自噬中的调控功能十分必要。

图1 Nat3是自噬过程的重要调控因子

为了揭示Nat3调控自噬的分子机制，作者从预测的Nat3底物中鉴定到两个自噬相关蛋白——Act1和Vps1。为了确定Nat3是否介导Act1和Vps1的Nt-乙酰化，作者用Nt-乙酰化抗体 (anti-Ac-M) 捕获含Nt-乙酰化的蛋白，分别用Act1和Vps1的抗体检测，结果发现这两个蛋白都存在Nt-乙酰化修饰。然后，作者通过质谱再次验证了Vps1和Act1的N末端Met残基的确存在乙酰化修饰。

图2 Nat3可使Act1和Vps1蛋白的N端发生乙酰化

接下来，作者对Vps1在自噬中的调节作用进行详细研究。Vps1缺失的酵母细胞积累明显的GFP-Atg8的聚集信号，且细胞中积累的自噬体是封闭的，这些结果表明Vps1可能促进自噬体与液泡融合的过程。为了确定Nt-乙酰化对Vps1功能的重要性，作者构建了两个突变体——D2M (组成型Nt-乙酰化) 和D2P (组成型非Nt-乙酰化) 。D2M突变体恢复了自噬底物转移表型，而D2P突变体不能。D2P突变体也会导致闭合自噬体的积累。这些结果表明，Vps1的Nt-乙酰化在自噬体与液泡的融合过程中发挥重要作用。
 
WT和D2M突变体中的Vps1与SNARE成员Vam3存在强相互作用，但D2P突变体与Vam3的互做明显减弱。Nat3突变后，Vam3与其他SNARE成分 (如Ykt6和Nyv1) 的结合也有所减弱。这些结果表明，Nat3催化Vps1 Nt-乙酰化并通过调节SNARE复合物的形成来控制自噬体与液泡的融合。

图3 Nt-乙酰化对于Vps1在自噬体-液泡融合中的作用

随后，作者对Act1在自噬中的功能进行研究。破坏Act1形成的肌动蛋白丝导致自噬过程受阻，进一步发现，干扰肌动蛋白丝阻碍自噬体的形成。Nat3突变体中，肌动蛋白丝的形成能被组成型Nt-乙酰化的Act1回补，表明Act1的Nt-乙酰化调节其细丝的形成并进一步促进自噬体的形成。
 
Atg9运输囊泡并将膜组分从高尔基体运输到吞噬体组装点，促进自噬体形成。作者发现Atg9囊泡与WT细胞中的肌动蛋白共定位，但这种共定位在Nat3突变细胞中不存在，这与Nat3缺失或D2P突变降低Atg9和Act1之间互作的结果一致。进一步观察发现，Nat3突变细胞在诱导自噬后，Atg9向吞噬体组装位点的运输受限，Atg9运出高尔基体的过程被阻止。这些结果表明，Act1 Nt-乙酰化调节Atg9囊泡运输和自噬体形成。

图4 由Nt-乙酰化Act1形成的肌动蛋白丝促进自噬体形成

综上所述，作者解析了Nt-乙酰化酶Nat3在自噬调控中的分子机制：Nat3 Nt-乙酰化Act1，Nt-乙酰化的Act1形成肌动蛋白丝，促进Atg9囊泡的运输和自噬体的形成 (上游调节过程) ；Nat3 Nt-乙酰化Vps1，Nt-乙酰化的Vps1募集并促进SNARE复合物的连接，促进自噬体与液泡的融合 (下游调控过程) ，所以，该研究证明了蛋白质Nt-乙酰化通过调控多个步骤在自噬中起重要作用。

图5 Nat3通过Nt-乙酰化Act1和Vps1分别在自噬过程的上游和下游发挥调控作用

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