一区 | IF:14.553多发性硬化症的相关空间代谢组学研究

蛋白组学、代谢组学服务专家

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● 前言

本文为伦敦帝国理工学院Zoltan Takats教授课题组在ACS central science期刊发表的题为“Correlated Heterospectral Lipidomics for Biomolecular Profiling of Remyelination in Multiple Sclerosis"的研究成果，通过拉曼+空间代谢组学+IHC研究方法，发现了新形成的髓鞘与正常髓鞘具有不同的脂质成分，探究了多发性硬化中再髓鞘化形成的机理，描绘了用于关联生物分子结构和髓鞘成分的分子成像图谱，为评估再髓鞘化治疗提供新策略。

中文标题：多发性硬化髓鞘再分化的分子成像图谱研究

研究对象：小鼠大脑/人脑组织

发表期刊：ACS central science

影响因子：14.553

发表单位：伦敦帝国理工学院

运用生物技术：拉曼光谱、空间代谢组学、免疫荧光成像

● 研究背景

多发性硬化症是一种神经退行性疾病，特征是多灶性炎性脱髓鞘病变。在许多多发性硬化病变中，髓鞘再生在一定程度上会发生，但这一过程在个体病变和不同患者之间以及在整个病程中有所不同，随着时间的推移，再髓鞘化不可避免地失败。许多研究现在集中于发现增强再髓鞘化的治疗方法，旨在减少轴突变性和随后患者逐渐累积的残疾。到目前为止，大多数髓鞘表征都集中在髓鞘蛋白上，而不是脂质成分上。由于这些蛋白是膜结合或脂质锚定的，因此髓鞘疾病或修复的脂质组成的变化也可能是重要的。

由于拉曼光谱是无损的，不需要组织处理，它可以与其他补充技术相结合，如空间代谢组。研究中开发了一种新的基于拉曼光谱和空间代谢组学分析的脂质组学(HSL)成像策略，用于分子表征和定量再髓鞘形成，并通过特定髓鞘蛋白的免疫标记进行了验证。利用拉曼和空间代谢组学数据生成了分子成像图谱，用于体外组织的生物分子结构和组成的关联。将相关脂质组成像方法应用于局灶性脱髓鞘小鼠模型和多发性硬化症死后脑标本的髓鞘再分化研究。发现不仅在脱髓鞘脑组织和正常脑组织之间，在有髓鞘组织和正常有髓组织之间，脂质成分皆存在差异。

● 研究思路

图1 | 研究思路

● 研究结果

1. 脑组织样本的拉曼光谱、空间代谢组学和免疫荧光成像

获得了一张高分辨率的拉曼光谱图像(∼9500×6100μm，空间分辨率为∼10μm)，这张正常的脑冠状切片(图2A),可直观显示中枢神经系统的结构特征(图2A、B、D)。图2E，F中示出了代表性的平均拉曼光谱(使用k-均值聚类，n=2个簇来识别)。对单个有髓组织成分光谱的分析证实，构成有髓组织光谱的主要分子是脂质，包括脑苷脂、胆固醇、鞘磷脂、磷脂酰胆碱，以及程度较小的蛋白质(图2F)。

通过相关免疫荧光证实了MBP(髓鞘碱性蛋白)、TUJ1(β3微管蛋白)和DAPI(细胞核)的拉曼光谱的分子特异性(图2C)。表明拉曼光谱成像提供了关于组织中不同生物分子特征的非常详细的信息，下至细胞水平(图2D)，类似于传统的免疫标记技术。由于免疫染色本质上是破坏性的，在连续的脑切片中，作者进行了空间代谢组学(∼50μm的空间分辨率)，并根据m/z848.63和m/z844.52对主要的髓鞘标志物进行了成像，推测它们分别属于Cer(D18：1/24：1)和PC(38：6)(图2G)。白质和灰质的代表性质谱如图2H所示。结果表明，使用拉曼光谱结构信息和空间代谢组学对髓鞘中的脂质进行特定的成分分析是可能的。

图2 | 小鼠大脑的拉曼光谱、解吸电喷雾电离质谱和免疫荧光成像

（a）小鼠脑冠状切片图像显示亮场图像和拉曼光谱图像

（b）脂质，蛋白质和DNA的拉曼光谱覆盖层

（c）髓鞘结合蛋白(MBP)、Tuj1 (III类β -微管蛋白)和4 ''，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的代表性染色

（d）小鼠大脑感兴趣区域的高分辨率显微拉曼图像(200×200μm)，显示与脂类(2885 cm−1)、蛋白质(2940 cm−1)和DNA (3000 cm−1)相关的拉曼光谱峰

（e）K-means聚类(n= 2个聚类)显示不同的脑组织特征

（f）与twok-means团簇相关的代表平均拉曼光谱

（g）根据m/z848.63和m/z844.52，主要髓鞘的空间代谢组成像显示灰质和白质分离，推测为Cer(D18：1/24：1)和PC(38：6)

（h）灰质和白质的代表性的平均空间代谢质谱图(分别以绿色和红色表示)

通过使用开发的计算框架(图3A−C)以像素方式配准拉曼和空间代谢组的成像。生成空间代谢组谱图和拉曼相关图，从而能够将振动光谱检测到的结构特征分配给通过质谱检测到的单个分子物种(图3D，E)。一般说来，数据显示了与多种不同脂质相关的拉曼振动峰之间的高度相关性。由于可以获得很好的相关性，作者随后对拉曼光谱和质谱进行了PLS多元回归。用作为例子，作者回归了m/z844.52pC(38：6)的拉曼光谱。回归载体显示高度特异的脂峰，表明对磷脂酰胆碱具有特异性(图3F)。回归分析表明，可建立高度线性关系(校正R2=0.825)(图3G)。假设在一级近似下质谱与浓度的线性关系，这个基于拉曼的模型可以作为复杂组织中特定脂质种类的预测因子。这些结果代表了使用基于结构和生物分子信息的互补光谱模式的脂肪组谱的新证明。

图3 | 点状拉曼和空间代谢组。拉曼和空间代谢组高光谱图像之间的相关图(负模式)

（a）显示基准标记位置的设计图像，以及B中为拉曼离子图像标记的相应位置。

（c）变换后的空间代谢图像，其感兴趣区域显示用于对空间代谢组和拉曼数据进行相关分析的像素

（d）相关阈值设置为0.2

（e）相关系数阈值设为0.7。在D和E中，与p> 0.05的相关性均不显著

（f）最小二乘回归向量表明该模型对脂质特异性峰值m/z844.52敏感

（g）PLS回归显示调整后的R平方为0.825的预测模型

2.小鼠模型中的脂质成像研究

将相关脂质组成像（HSL）特性应用于脱髓鞘小鼠模型的组织。使用了一种基于立体定向注射溶血磷脂酰胆碱(LPC)到小鼠胼胝体的局灶性脱髓鞘模型。在固定的脑冠状切片上获得了胼胝体的高分辨率拉曼光谱图像(n=15)。分析了LPC注射后第14天、第21天和第28天的切片，以覆盖从脱髓鞘到完全再髓鞘的整个过程(注射后第28天)（样本策略）。使用了两个对照：未注射的小鼠(对照)和仅在注射后第14天注射生理盐水的小鼠(即，没有脱髓鞘)。图4A显示了两个纯粹的多元曲线分辨率（MCR）基谱。由于MCR是基于光谱方差，并且由于髓磷脂的数量是图像中显著的光谱变异性的来源，因此MCR能够估计髓磷脂的光谱(图4A)。通过比较图谱中的强相关性(图3D，E)，也可明显看出这一点。

为验证髓鞘定量的拉曼髓鞘形成指数（RMI），在同一组织上进行了髓鞘碱性蛋白（MBP）和4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的相关免疫组织化学染色，并使用免疫荧光图像在每个切片上确定注射和非注射的感兴趣区(ROI)。每个样本的注射侧和非注射侧的密度比被归一化为从未处理的小鼠的对照切片获得的值。汇总不同时间点的平均RMI±1标准误差(SE)(图4C左面板)。定量结果显示，注射后第14天髓鞘减少52%，与对照组相比有显著性差异(p<0.05)。在再髓鞘形成过程中，损伤诱导后第21天，RMI比对照组增加62%，28天后逐渐恢复到对照水平。这些值与在相关免疫荧光图像上进行的MBP密度分析有很好的相关性(图4C中央面板)。随着脱髓鞘病变中小胶质细胞/巨噬细胞浸润的增加，拉曼光谱还显示了胆固醇酯的存在，通常在病变部位周围，为髓鞘降解的最终产物，它被这些细胞执行，然后被清除。

图4 | 使用RMI对小鼠模型中的再髓鞘形成进行量化

（a）MCR去除了代表脱髓鞘组织和有髓组织的纯成分，这些组织有明显的脂质特征。有髓组织与脱髓鞘组织的比率用于形成RMI(最相关的峰被突出显示)

（b）分别于注射LPC后第14、28天进行RMI、MBP相关免疫组化染色和4‘，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。比例尺：500μm。

（c）注射后14、21和28天，平均RMI、MBP和DAPI折叠变化±1个标准误差，与对侧大脑半球相比。还显示对照组(未治疗)和生理盐水注射(第14天)。*指示P<0.006(单因素方差分析：RMI倍数变化P=0.006，Newman−Keuls后试验LPC第14天与第28天/对照/Salinep<0.05；BP倍变化P=0.002，Newman−Keuls后试验LPC第14天与第28天/对照P<0.05)

评估拉曼分析是否能够识别不同髓鞘形成水平的特定生物分子结构差异。使用上述的ROI作为指导计算平均拉曼光谱±1 SD（图5A），计算每个时间点的平均差光谱，以揭示样品之间细微的分子差异（图5B）。光谱分析表明脱髓鞘病变与明显的拉曼光谱轮廓相关，正常有髓和再髓鞘组织（LPC注射后第28天）之间存在光谱差异。对第28天的组织(有髓鞘)进行了PLS-DA，与对侧对照和灰质组织进行了比较。前4个潜变量主要对应于脂类峰(如1440处的CH2变形和1650 cm−1处的C-LativeC伸展)(图3D)。构建胼胝体图像，显示每个像素属于注射侧（红色）或非注射侧（绿色）的概率（图5C）。结果表明，拉曼成像可以在一定程度上区分髓鞘再生过程中新形成的髓鞘与正常髓鞘。

根据拉曼光谱，从新鲜小鼠大脑样本（再髓鞘损伤（第28天注射侧）和对侧正常侧（非注射侧））获取空间代谢组学图像。计算了负离子和正离子模式下的平均空间代谢质谱（图5D，G）以及平均差谱，以突出不同样品的空间代谢质谱之间的差异（图5E，H）。制作的图像显示了属于注射侧（红色）或非注射侧（绿色）的后验概率。该分析基本证实了拉曼光谱特征，与对侧正常侧（非注射侧）相比，再髓鞘损伤（注射侧）发生了高度特异性的分子变化，尤其是正离子模式（图5F，I）。随后通过串联质谱法确认了区分胼胝体再髓鞘化和正常髓鞘化区域的最显著峰，并在表1中报告。拉曼光谱和空间代谢组学表明，再髓鞘化区域的脂质成分不同于原始髓鞘的脂质成分。从小鼠模型获得的结果证明了HSL成像可以有效地研究再髓鞘化病变的脂质分布，这是脱髓鞘后新形成的髓鞘与正常髓鞘相比具有明显的分子特征和相对脂质成分差异的第一个直接指标。

图5 | 局灶性脱髓鞘小鼠模型中有髓损伤的脂质成像研究

(A，B)正常有髓组织(非注射侧)和有髓组织(注射侧，注射毒素后第28天)的平均拉曼光谱±1标准差(SD)

（b）平均差谱±1SD(注射侧，对侧)显示结构水平的再髓鞘形成过程。

（c）基于再髓鞘标本拉曼光谱的PLS-DA后验概率图区分对照侧(绿色)和注射侧(红色)。黄色代表几乎相等的概率。

（d,g）正常有髓组织(未注射侧)和有髓组织(注射侧，注射毒素后第28天)的平均空间代谢质谱分别为负离子模式和正离子模式

（e,h）在负离子模式和正离子模式下，有髓鞘(注射毒素后第28天)和对照未注射侧的平均差值分别为：负离子模式和正离子模式。

（f,i）基于空间代谢组负离子模式和正离子模式的MMC-LDA后验概率分别属于对照侧(绿色)和注射侧(红色)。比例尺250μm。

3.脂质组成像策略在多发性硬化患者脑样本中的应用

将HSL方法应用于人类尸检样本中的多发性硬化病变，以进行无标记病变分类和脂质组成像分析。从8名多发性硬化患者中获得了正常对照组脑样本（n=4）和多发性硬化脑样本，其中包括慢性活动性脱髓鞘病变（n=6）、慢性非活动性脱髓鞘病变（n=8）和再髓鞘病变（n=4）（样本策略）。从正常对照组织（n=29316光谱）、慢性活动性和非活动性多发性硬化病变（n=14354光谱）和再髓鞘化病变（n=39446光谱）共测量了83116个拉曼光谱（图6A）。计算了差异光谱±1 SD，以揭示与每种组织类型相关的分子差异（图6B）。尽管开发的基于像素的共注册HSL图谱（图3）基于小鼠组织，但也为解释人体组织的拉曼光谱提供了信息。与小鼠模型中的再髓鞘化相比，多发性硬化再髓鞘化病变显示出较少的完全再髓鞘化，如1302、1445和1650 cm−1处较低的脂质峰强度所示.线粒体也有更明显的峰，1585cm−1与病变细胞浸润有关（图6B）。

在小鼠模型中，基于拉曼光谱的分析不仅成功地识别了脱髓鞘病变的特异性特征，而且还识别了再髓鞘病变的特异性特征。为了进一步研究这些成分差异，作者通过比较8例多发性硬化患者大脑的再髓鞘化病变（通过组织病理学分类确定）（样本策略），进行了相关的空间代谢组学研究来自同一患者的正常白质组织，旨在获得与患者再髓鞘病变相关的特定脂质谱（图6D−1）。通过串联质谱法确认鉴定的脂质，并在表2中报告。正如在小鼠组织分析中所观察到的，再髓鞘化区域主要在PC和PE脂质群的组成上不同。结果表明，HSL成像可以有效地用于多发性硬化患者死后病变的脂质谱分析，并表明多发性硬化患者再髓鞘化过程中产生的髓鞘与附近正常出现的白质相比具有改变的脂质谱。

图6 | 多发性硬化症人脑的脂质组成像研究

（a）正常白质(NAWM)和有髓鞘病变的平均拉曼光谱±1标准差(SD)。

（b）平均差谱±1SD(NAWM−再髓鞘损伤)在结构水平显示再髓鞘过程。

（c）基于有髓损伤的拉曼光谱的PLS-DA后验概率图像突出NAWM(绿色)和有髓组织(红色)。

（d,g）负离子和正离子模式下NAWM和再髓鞘化病变的平均空间代谢组质谱。

（e,h）NAWM和再髓鞘化病变的负离子和正离子模式的平均差谱。

（f,i）基于空间代谢组负离子模式和正离子模式的MMCLDA后验概率分别属于NAWM（绿色）或再髓鞘病变（红色）。黄色代表几乎相等的概率。比例尺750μm

● 研究结论

研究开发了一种脂质组成像(HSL)方法来量化和表征诱导性局灶性脱髓鞘小鼠模型和人类多发性硬化症病变中的再髓鞘形成。展示了拉曼光谱和空间代谢组成像技术的应用。这一分析首次表明脱髓鞘后新形成的髓鞘具有与正常髓鞘不同的脂质成分。因此，这种HSL方法学可能大大提高目前对多发性硬化症再髓鞘形成的理解，并可能为多发性硬化症研究中评估再髓鞘形成治疗提供一种新的策略。此外，HSL方法可以针对广泛的组织量身定做，为生物医学科学中的脂质结构和成分提供至关重要的见解。

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该研究开发了一种基于拉曼光谱、解吸电喷雾电离质谱（空间代谢组学）和免疫荧光成像的相关脂质组成像（HSL）方法，研究多发性硬化症病变中的再髓鞘形成与正常髓鞘不同的脂质成分。结果通过对脂质结构和成分的研究为再髓鞘化治疗提供可能性。

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