有何不同？磁珠/微球在单细胞测序技术平台应用解析！

2021-11-10 18:17:32, Dr. BEAVER

序章

单细胞测序技术，是指在单个细胞水平上对其携带的遗传信息进行测序，广泛应用于新物种鉴定、病原筛查、神经科学、肿瘤异质性研究以及循环肿瘤细胞等方面。

单细胞测序主要包括单细胞基因组测序技术、单细胞转录组测序技术、单细胞表观遗传测序技术、单细胞蛋白质组学测序技术、单细胞多组学联合分析等方面。

单细胞测序技术主要过程包括：单细胞样本准备、细胞富集，单细胞分离，建库、测序五部分。

单细胞测序技术流程

单细胞测序技术

磁珠/微球在单细胞测序中的应用

这得从现有的技术平台原理解析开始，下面以单细胞转录组测序技术为例。

目前，单细胞测序目前已进入2.0时代，高通量单细胞捕获有两大策略，一种是微流控芯片技术，以10X Genomics、Drop-seq、inDrop为代表。另一种，微孔板（microwell）技术，以BD Rhapsody、Seq-Well为代表。

微流控芯片技术平台:1个液滴=1个细胞+1个凝胶微球=1个RNA Seq

微流控芯片技术是将单个细胞和单个凝胶微球包裹在一个液滴内，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA；液体油层破坏后，cDNA后续进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成上万个细胞的捕获，从而达到在单细胞水平进行表达测序的目的。

适用范围：

直径40μm以下细胞（受仪器管道直径限制）。

大规模细胞样本，适用于分群、谱系等研究。

10X Genomics工作原理（来源10X Genomics官网）

图：10x Genomics平台利用微流控技术，将带有Cell Barcode的凝胶微珠和单个细胞包裹在同一个“油包水”液滴中。

10X Genomics工作原理（来源10X Genomics官网）

图：Barcode序列作用是区分不同的细胞，UMI是用来区分不同转录本的PCR产物，最后一段为poly dT反转录引物。（图片来源10x Genomics官网）

微孔板技术平台:1个微孔=1个细胞+1个磁珠=1个RNA Seq

微孔板技术是将单个细胞和单个磁珠沉降到1个微孔内，磁珠上的序列结构与 10X Genomics 相似，可以捕获到游离mRNA的poly A尾。

适用范围：

直径<20μm的细胞（受磁珠结合效率限制）。

大规模细胞样本，适用于分群、谱系等研究。

图片来源BD官网

图：BD Rhapsody是利用铺满20万个直径50μm微孔的微孔板和携带细胞标签的直径35μm磁性beads捕获细胞。将制备好的单细胞悬液铺至微孔板上，细胞靠自身重力沉降至微孔底部。加入细胞裂解液，细胞释放出的mRNA可以被poly dT的beads在微孔中捕获。

Univ = Universal sequence, CL = Cell label, UMI = Unique Molecular Index

图：利用磁铁回收beads到单管中进行后续逆转录、建库等操作。（图片来源BD官网）

在两个技术平台中，微球/磁珠都作为mRNA的捕获载体，是单细胞测序过程中不可或缺的一个原料。相比普通微球而言，磁珠能够通过磁铁简单快速的从体系中去除，在样本处理过程中具有更明显的优势，受到越来越多科学家和产品开发者的青睐。

两个技术平台对磁珠/微球的需求

	微流控芯片技术	微孔板技术平台
产品特性	凝胶微球	磁性微球
	柔性材质	刚性材质
	粒径较大，50μm左右	粒径偏小，20-35μm左右
	单分散	单分散
	微球可降解，以释放primers	磁珠无需降解，在磁珠表面进行反转录，通过酶切将磁珠和cDNA分离
	对PCR无抑制	对PCR无抑制